PEPT2 mRNA在肺纖維化大鼠肺組織中的表達

李莉 王殿華 張旋 宋鑫 馬曉骉 胡早秀

肺纖維化（pulmonary fibrosis, PF）是肺的炎癥改變及纖維重塑同時存在的一種疾病。在肺癌的放化療過程中，如博來霉素（bleomycin, BLM）的應用常常可以導致非特異性肺炎和肺纖維化[1,2]。氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞中的藥物濃度與肺纖維化疾病療效密切相關，肺泡和支氣管上皮就成了藥物運輸和治療的主要靶標[3]。因此，如何將高濃度的藥物轉運到肺部是治療肺纖維化疾病的關鍵。

肽轉運載體2（peptide transporter 2, PEPT2）定位于支氣管上皮細胞、II型肺泡上皮細胞和小血管的內皮細胞中，可以通過底物轉位與作為驅動力的跨膜電化學質子梯度相偶聯，轉運肽和肽類藥物。轉運效率較高，并可以降低給藥劑量，減少全身副反應的發生[4,5]。目前，肽轉運載體已經成為合理設計肽和肽類藥物如抗腫瘤、抗生素及抗病毒藥物的靶標。因此，研究PEPT2在治療肺疾病中的作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠50只（200 g±20 g），雌雄各半，由昆明醫科大學實驗動物中心提供；博萊霉素（日本化藥株式會社）；羥脯氨酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與動物模型復制 50大鼠隨機分為5組，每組10只。正常對照組不作任何處理；生理鹽水組：氣管內一次性滴入0.2 mL生理鹽水，14 d后予股動脈放血處死；博萊霉素7 d、14 d、28 d組：氣管內一次性滴入0.5%的BLM溶液5 mg·kg-1，復制肺纖維化模型，分別于給藥后7 d、14 d和28 d予股動脈放血處死取肺組織。

1.2.2 肺組織形態學觀察 股動脈放血處死實驗動物，開胸取右肺下葉，用10%中性甲醛固定24 h后，常規石蠟包埋、切片，HE染色和GS染色后光鏡下觀察肺組織形態結構。

1.2.3 肺組織中羥脯氨酸（hydroxyproline, HYP）含量測定采用堿水解法測定大鼠肺組織中HYP的含量，反映肺纖維化的程度。

1.2.4 RT-PCR檢測 取肺組織樣品100 mg，將組織剪碎，加入1 mL Trizol。用勻漿器充分勻漿，用氯仿、異丙醇、75%乙醇提取肺組織總RNA。采用第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，PEPT2序列5'-GCTGCCTACTGAAGCCAAATGCTTG-3'及5'-AGAGGCTGCTGAAGGCATGGT-3'；內參照采用GAPDH，引物序列為5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'及5'-TTTGAGGGTACAGCGAACTT-3'，擴增片段長度為327 bp。PCR反應：模板濃度為60 pg，94oC變性1 min，55oC退火1 min，72oC延伸1 min，擴增28個循環，72oC延伸10 min。

1.2.5 RT-PCR產物半定量測定 由上海生工生物有限公司進行PCR產物測序，使用FASTA與基因庫中大鼠PEPT2序列進行同源性比較；用GelDoc凝膠成像系統進行檢測，并用Quantity One軟件對各陽性條帶的光密度進行測定，以PEPT2與GAPDH的光密度比值表示PEPT2 mRNA的相對表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，結果用Mean±SD表示，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BLM致大鼠肺纖維化組織形態學變化 HE染色光鏡觀察發現：BLM 7 d組大鼠肺泡腔內滲出物增多，局部有少量出血，肺泡壁內和肺間質內有中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，可見少量成纖維細胞，存在局部萎陷及小血管壁增厚，呈彌漫性肺泡炎改變；BLM 14 d組大鼠部分肺組織呈片狀實變，肺泡上皮細胞增生，肺泡壁增寬，片狀肺泡腔縮小或消失，個別肺泡腔內可見泡沫細胞，肺泡間質內可見少量炎細胞浸潤，細支氣管上皮細胞增生，腔內可見脫落壞死的上皮細胞；BLM 28 d組大鼠部分肺組織呈片狀實變，肺泡腔廣泛的縮小或消失，肺泡壁增寬，纖維化；在肺泡間質、肺泡腔內可見較多淋巴細胞、漿細胞等炎性細胞浸潤，肺泡壁毛細血管擴張，見圖1。GS染色結果顯示：BLM 14 d組大鼠肺內膠原纖維數量及分布基本正常，局部網狀纖維大量增生；BLM 28d組大鼠肺內大量增生的網狀纖維中出現增生的膠原纖維島，見圖2。

2.2 BLM致肺纖維化大鼠肺組織羥脯氨酸含量的變化BLM致大鼠肺纖維化過程中，大鼠肺組織HYP含量隨時間增長逐漸升高，BLM 7 d組肺組織HYP含量與正常對照組、生理鹽水組相比無統計學差異（P＞0.05），14 d 組和28 d組大鼠肺組織HYP含量依次增高，且均高于正常對照組和生理鹽水組（P＜0.05），見圖3。

2.3 半定量 RT-PCR檢測肺纖維化大鼠肺組織PEPT2 mRNA表達 RT-PCR產物測序結果與GenBank中大鼠PEPT2序列進行同源性比較，結果顯示與GenBank中大鼠PEPT2（基因登錄號：D63149，gi: 1374711）cDNA序列幾乎完全一致，同源性高達99.3%（284/286），RT-PCR產物序列（1 bp-284 bp）與大鼠PEPT2 cDNA序列的154 bp-437 bp完全一致。此結果證實了RT-PCR產物為大鼠PEPT2 cDNA片段。

各組大鼠肺組織PEPT2和GAPDH凝膠電泳圖，用凝膠成像系統進行檢測可見PEPT2的長度為327 bp，內參GAPDH的長度為252 bp，見圖4A。測定PEPT2 mRNA和GAPDH陽性條帶的光密度百分數，以PEPT2與內參GAPDH的光密度百分數的比值表示相對表達量，各實驗組肺組織PEPT2 mRNA相對表達量的差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4B。

圖 1 各組大鼠肺組織的病理改變（HE，×80）。A：對照組；B：生理鹽水組；C：博來霉素7天組；D：博來霉素14天組；E：博來霉素28天組。Fig 1 Histopathologic changes of lung tissue in each group (HE, ×80). A: control group; B: normal saline solution (NS) group; C: bleomycin (BLM) 7 d group; D: BLM 14 d group; E: BLM 28 d group.

圖 2 生理鹽水組（A）、BLM 14 d（B）和28 d（C）組大鼠肺組織GS染色圖（×80）Fig 2 GS staining of lung tissue of NS (A), BLM 14 d (B) and 28 d (C) groups (×80)

圖 3 各組大鼠肺組織的HYP含量Fig 3 Content of hydroxyproline (HYP) of lung tissue in each group. Vs control group: △P=0.240; ▲P=0.132; *P＜0.001; #P＜0.001.

3 討論

PEPT2屬于H+依賴性寡肽轉運載體家族（family of proton-dependent oligopeptide transporter, POT），可在肺、腎臟、大腦、脾和乳腺等組織表達[6,7]。在肺部，PEPT2 mRNA主要在支氣管上皮細胞、肺泡II型上皮細胞和小血管的內皮細胞表達[4,5]。PEPT2獨特的分子特征及其組織分布特點，可以將高濃度的抗生素、抗病毒藥物運輸到氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞中[4,5]。據報道[4-7]PEPT2可轉運仿肽類藥物如β-內酰胺抗生素、苯丁亮氨酸、腎素抑制劑。因此，肺組織中PEPT2 mRNA的表達量與藥物轉運效率密切相關。

放射治療是中晚期肺癌綜合治療的重要治療手段之一，且常常引起放射性肺損傷，最終導致肺纖維化[1,2]。廣泛應用的化療藥物如博來霉素，使用本藥10%-23%患者可發生肺毒性，表現為呼吸困難、咳嗽、胸痛、肺部啰音等，導致非特異性肺炎和肺纖維化，甚至快速死于肺纖維化[2,8,9]。肺纖維化是一種高致死率疾病，至今尚無有效的治療策略能阻止其自然進程和致死性[3]。研究[4,5]表明，氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞中的藥物濃度與肺纖維化疾病療效密切相關。因此，如何將高濃度的藥物轉運到肺部是治療肺纖維化疾病的關鍵。研究PEPT2蛋白在肺纖維化大鼠肺組織的表達，可有效地將治療肺纖維化疾病的新型肽類藥物及前體藥物運輸到肺部，提高肺組織局部的藥物濃度，從而促進治療肺纖維化疾病的新型藥物和新的治療策略的發展。

圖 4 各組大鼠肺組織中PEPT2 mRNA和GAPDH mRNA的變化。A：各組大鼠肺組織中PEPT2 mRNA和GAPDH mRNA的凝膠電泳圖。1：對照組；2：NC組；3：BLM 7 d組；4：BLM 14 d組；5：BLM 28 d組；B：柱狀圖顯示各組大鼠肺組織中PEPT2 mRNA和GAPDH mRNA光密度比值無統計學差異（P=0.696）。Fig 4 The change of PEPT2 mRNA and GAPDH mRNA of lung tissue in each group. A: Agarose gel electrophoresis of PEPT2 mRNA and GAPDH mRNA of lung tissue in each group.1: control group; 2: NS group; 3: BLM 7 d group; 4: BLM 14 d group; 5: BLM 28 d group; B: Compared the ratio of light density of PEPT2 and GAPDH mRNA which were products of RT-PCR each group in the lung tissue of rat. Vs betweem groups: P=0.696.

1996年，德國Boll教授[10]首先在腎臟發現具有高親和力的肽及肽類藥物轉運蛋白PEPT2，并鑒定其分子結構。1999年Grondberg[11]首次通過Northerning blot和RTPCR技術研究表明PEPT2可在正常大鼠呼吸道中表達。隨后開展了針對正常動物肺組織中PEPT2的結構、功能和分子特征的大量研究[4,6,7,12,13]。但迄今為止，國內外對肺部疾病狀態下PEPT2 mRNA在動物肺部表達水平的研究較少。

動物模型是否復制成功有一定的評價指標，目前評價該模型是否建立，最主要的指標是對肺組織進行病理組織學評價，其次還有肺膠原蛋白及纖維蛋白的代謝產物含量的測定等[9]。本研究在成功復制的肺纖維化大鼠動物模型上，采用半定量RT-PCR技術檢測PEPT2 mRNA在大鼠肺部的表達水平。結果發現BLM各組大鼠肺組織PEPT2 mRNA表達水平與正常組大鼠和生理鹽水組大鼠相比無統計學差異（P＞0.05）。這表明PEPT2 mRNA在BLM致肺纖維化大鼠肺組織表達水平無明顯變化。

PEPT2為高親和力低容量轉運載體，正常狀態下可轉運大量藥理活性底物致肺部，肺部疾病狀態下，由于PEPT2 mRNA在肺纖維化大鼠肺組織表達水平無明顯變化，表明在肺纖維化時，可以通過肺部給藥方式給予肽和肽類藥物，降低藥物的蛋白分解作用和避免肝臟的首過效應，使其通過PEPT2蛋白轉運作用，將高濃度的藥物轉運到靶位，提高局部的藥物濃度，增加其生物利用度，從而提高藥物療效。本實驗通過研究藥物作用的靶點——肽轉運載體PEPT2蛋白在肺纖維化狀態下的表達情況，可為研制高效低毒的新型肽類藥物提供實驗依據。