烯醇化酶ENO1抑制非小細胞肺癌細胞上皮間質轉換

周鑫 張瑩 韓廼珺 郭素萍 肖汀 程書鈞 高燕寧 張開泰

Elizabeth Hay于1968年提出上皮間質轉換的概念，并指出這種轉換在一定條件下是可以逆轉的[1]。事實上，EMT過程在后生動物的整個生命周期中都起到重要作用，如發育、組織損傷修復、纖維化，以及某些病理過程（如惡性腫瘤的轉移）[2]。最新的統計[3]顯示，肺癌死亡率仍高居各類癌癥之首。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）主要起源于上皮組織，因此大部分癌細胞維持上皮樣特性，小部分細胞會通過EMT獲得成纖維細胞樣形態，失去胞間粘附并獲得移動能力[4]。在分子水平上，這部分間質樣細胞通常丟失E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、橋粒斑蛋白（Desmoplakin）和緊密連接蛋白（zonula occluden, ZO-1）等上皮樣細胞表面分子，而獲得間質樣細胞標志如N-鈣粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin），伴隨著相關轉錄因子Twist、Snail和Slug的表達上調[5]。EMT是包含一系列精細復雜的變化，多種信號通路都參與其中，主要包括Wnt信號通路、TGFβ信號通路、Notch信號通路、Hedgehog信號通路、磷脂酰肌醇激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K）信號通路、核因轉錄因子（nuclear factor-κB, NF-κB）信號通路和ERK信號通路等；此外，還有多種microRNA參與這一過程的調控，如miR-155、miR-200和miR-205[6,7]。

除了肺癌，在諸如結腸癌[8]、胃癌[9]和乳腺癌[10]等多種實體瘤的研究中，都發現發生EMT的腫瘤細胞具有更高的惡性程度。并且，原發灶的腫瘤細胞出現EMT，常常預示著較差的臨床預后。一項針對EMT相關轉錄因子Slug的臨床研究[11]發現，肺癌組織中其mRNA水平越高，患者的術后復發幾率越高，生存期越短。

相比于正常組織，腫瘤組織即使在有氧條件下糖酵解過程也明顯加強，并且相關酶類活性和表達水平都有所提高，即Warburg效應[12]。隨后更多研究發現，糖酵解過程相關酶類如己糖激酶（hexokinase-2, HK-2）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase-A, LDH-A）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH）和ENO1，實際上是具有包括催化活性在內的多功能蛋白[13]。編碼ENO1的mRNA可以通過選擇性翻譯，表達另一種短異構體c-Myc啟動子結合蛋白1（c-Myc promoter binding protein-1, MBP-1）[14]。多種證據表明在乳腺癌[15]、NSCLC[16]、丙肝病毒相關肝細胞肝癌[17]、前列腺癌[18]和神經膠質瘤[19]中，ENO1和MBP-1都參與了癌癥的發展過程。在人乳腺癌細胞MCF-7中過表達MBP-1，可以抑制細胞的侵襲能力[15]。在胃癌中，ENO1和MBP-1可以通過抑制環氧合酶（cyclooxygenase-2, COX-2）表達抑制細胞EMT過程，從而抑制細胞侵襲和轉移能力[20]。目前，ENO1對肺癌細胞EMT的影響，沒有明確闡述。

本研究旨在揭示ENO1對NSCLC細胞系A549的EMT過程的影響，及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 野生型和突變型ENO1基因的克隆和真核表達質粒的構建 以人胚胎cDNA文庫作為模板，利用LATaq聚合酶（Takara，日本）克隆野生型ENO1全長；并構建至pcDNATM3.1/myc-His(-)A載體（Invitrogen，美國）中。隨后，利用PCR引入點突變的方法，將野生型ENO1第94和97位氨基酸對應密碼子ATG突變為CTG。突變型ENO1m同樣構建于pcDNATM3.1/myc-His(-)A載體中。目的片段序列測定由上海生工生物工程公司完成。

1.2 細胞培養、脂質體介導的細胞轉染 人NSCLC細胞系A549（ATCC，美國），在含有10%胎牛血清的RPMI-1640（Invitrogen，美國）完全培養基中置于5%CO2、37oC條件下培養。當細胞融合度達到90%時進行質粒轉染，按照LipofectamineTM2000（Invitrogen，美國）產品說明書操作。轉染質粒24 h后，替換含終濃度為600 μg/mL G418的完全培養基中進行篩選，并維持選擇壓力，從而獲得穩定過表達ENO1的細胞亞群，命名為A549-ENO1。對照組轉染空載質粒，命名為A549-Ctrl。

1.3 劃痕實驗 當細胞融合度達到100%時，在培養皿中均勻劃出三道劃痕。磷酸鹽緩沖液洗滌去除劃下的細胞。加入含2%胎牛血清的RPMI-1640培養基，于37oC、5%CO2條件下培養，此時記為第0天，并拍照記錄。隨后，每隔24 h更換含2%胎牛血清的培養基并拍照記錄。

1.4 TGFβ-1誘導上皮間質轉換實驗 當細胞融合度在90%時，吸盡培養基，并用磷酸鹽緩沖液洗滌。細胞經無血清培養饑餓24 h后，添加指定濃度TGFβ-1（R&D，美國）處理24 h，并拍照記錄。

1.5 EGF刺激實驗 當細胞融合度在50%-70%時，吸盡培養基，并用磷酸鹽緩沖液洗滌。細胞經無血清培養基饑餓4 h后，加入終濃度為20 ng/mL的EGF（Cell Signal，美國）處理1 h。

1.6 細胞總蛋白的提取和Western blot分析 以適量含有1%苯甲基磺酰氟（PMSF）、1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液（普利萊，中國）提取細胞總蛋白。采用BCA Protein Assay Kit（Thermo，美國）進行蛋白定量后用于Western blot分析。所用主要抗體及稀釋比：ENO1（1:1,500，奧維亞，中國）、ERK1/2（1:2,000，Santa Cruz，美國）、p-ERK1/2（1:1,000，Santa Cruz，美國）、p-MEK1/2（1:1,000，Cell Signal，美國）、E-cadherin（1:1,000，Santa Cruz，美國）、N-cadherin（1:1,000，BD，美國）、Vimentin（1:500，Santa Cruz，美國）和β-actin（1:5,000，Santa Cruz，美國）。

1.7 統計學分析 細胞劃痕實驗結果圖采用ImageJ2X（National Institutes of Health）采集數據，SPSS Statistics 17.0進行兩組獨立樣本t檢驗， P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選穩定過表達ENO1的A549細胞 收集篩選后的A549-ENO1和對照A549-Ctrl總蛋白，進行Western blot檢測。結果顯示，相比于對照組，A549-ENO1的ENO1表達水平更高（圖1）。

圖 1 Western blot鑒定外源性ENO1基因在A549細胞中的過表達Fig 1 The over-expression of exogenous ENO1 was examined by Western blot

2.2 過表達ENO1抑制細胞運動 劃痕24 h、48 h和72 h后，A549-ENO1劃痕僅愈合了19.6%、38.4%和63.4%，均低于對照組A549-Ctrl的34.5%、60.1%和85.9%（P＜0.05），表明ENO1過表達的A549細胞側向運動能力明顯下降（圖2A）。

2.3 過表達ENO1抑制EMT過程 相比于對照組，A549-ENO1細胞中上皮樣細胞標志物E-cadherin表達量明顯上升，間質樣細胞標志物N-cadherin和Vimentin的表達降低（圖2B）。TGFβ-1誘導EMT實驗結果顯示，較高濃度的TGFβ-1（2 ng/mL）處理24 h才能使A549-ENO1群體中出現較多的成纖維樣細胞；對照組A549-Ctrl在低濃度TGFβ-1（0.5 ng/mL）處理24 h后即出現較多的成纖維樣細胞（圖2C）。該結果說明ENO1過表達可以對TGFβ-1誘導A549細胞的EMT過程產生抑制效應。

2.4 ENO1抑制ERK磷酸化 相比于A549-Ctrl，A549-ENO1中磷酸化的ERK1/2水平明顯下降（圖3A）。細胞血清饑餓4 h后，用終濃度為20 ng/mL的EGF同時處理1 h后發現，A549-ENO1細胞中磷酸化的ERK1/2明顯低于對照組，而MEK1/2的磷酸化幾乎不受影響（圖3B）。因此，我們推測ENO1可以通過抑制ERK1/2的磷酸化來抑制A549細胞的EMT。

2.5 全長ENO1可以抑制EMT 野生型ENO1wt在第94和97位氨基酸殘基對應的密碼子是ATG，定點突變型ENO1m在對應位置為CTG（圖4A）。將野生型ENO1、突變型ENO1和空載質粒分別瞬時轉染A549細胞48 h后，檢測細胞中相關蛋白水平的變化，發現MBP-1表達沒有明顯的升高，并且突變型ENO1所產生的效應同野生型ENO1幾乎完全相同（圖4B）。這表明全長ENO1蛋白可以阻礙EMT過程。

3 討論

本實驗室利用新型蛋白質組研究體系建立了肺癌相關分泌/釋放蛋白數據庫，其中包含了ENO1在內的糖酵解途徑關鍵酶[21]；并且檢測到在NSCLC患者和正常對照組外周血中，ENO1蛋白水平具有明顯差異，因此，我們推測ENO1可能同NSCLC的發展具有密切聯系[22]。本實驗則針對ENO1在NSCLC細胞的EMT過程中的生物學功能進行了初步研究。

本研究在A549細胞系內穩定過表達ENO1，發現EMT相關分子標志物的改變和抑制ERK1/2磷酸化的現象，并導致A549細胞的運動能力下降。對比圖2C中未添加TGFβ-1處理的細胞，我們發現過表達ENO1會引起A549細胞形態更趨近于上皮樣細胞的變化，而對照組細胞更多地呈現出間質樣細胞的梭形特征。根據這些現象，我們提出了ENO1通過抑制ERK1/2磷酸化來抑制EMT的假設。隨后的TGFβ-1誘導EMT實驗和EGF刺激ERK1/2活化的實驗，均證實了這個假設。

在糖酵解過程中的很多酶都是多功能性的蛋白[13]。ENO1在不同的組織細胞中不同的生理和病理狀態下，甚至是在不同的細胞亞定位均能夠顯示出不同的功能[23]。Hsu等[20]發現細胞核中的ENO1/MBP-1可以作為轉錄因子降低COX-2的轉錄水平，抑制胃癌細胞的EMT。對ENO1在NSCLC中抑制EMT的作用仍然沒有解釋清楚。

圖 2 ENO1對A549細胞運動和EMT的抑制作用。A：劃痕實驗：在劃痕后第24 h、48 h和72 h連續觀察，過表達ENO1的A549細胞劃痕恢復能力明顯下降（*t檢驗，P＜0.05）。圖表縱坐標表示劃痕寬度相對0 h時劃痕寬度比，橫坐標表示時間；B：Western blot結果顯示，相對于A549-Ctrl，A549-ENO1細胞中，E-cadherin表達明顯增加，N-cadherin和Vimentin表達量明顯降低；C：梯度TGFβ-1誘導EMT實驗：低劑量（0.5 ng/mL）處理A549-Ctrl細胞即可出現大量間質樣細胞，而A549-ENO1細胞需要較高劑量（2 ng/mL）處理才能出現一定數量的間質樣細胞。Fig 2 ENO1 inhibits A549 cell mobility and EMT process. A: Wound-healing assay: a continuous observation showed that over-expression of ENO1 resulted in limitation of A549 mobility (*t-test, P＜0.05). In the chart, Y-axis represents the relative wound width and X-axis represents time period; B:Western blot assay: compared to A549-Ctrl, E-cadherin up-regulated in A549-ENO1, with down-regulation of N-cadherin and Vimentin; C: gradient dose of TGFβ-1 inducing EMT: quantity of mesenchymal-like cells were obtained in A549-Ctrl population after low dose (0.5 ng/mL) of TGFβ-1 inducing. Relative lower ratio of mesenchymal-like cells formed in A549-ENO1 population after high dose (2 ng/mL) of TGFβ-1 treatment.

圖 3 ENO1抑制A549細胞ERK1/2的磷酸化。A：同對照組相比A549-ENO1細胞中ERK1/2磷酸化水平明顯受限；B：20 ng/mL的EGF處理細胞，A549-ENO1的ERK1/2磷酸化水平仍然明顯低于對照組細胞，而MEK1/2磷酸化活化幾乎不受影響。Fig 3 ENO1 suppresses ERK1/2 phosphorylation in A549. Western blot result showed: A: Compared to A549-Ctrl group, ERK1/2 phosphorylation was inhibited by ENO1 over-expression; B: ERK1/2 phosphorylation level of A549-ENO1 was still lower than that of control group after EGF treatment, whereas MEK1/2 phosphorylation was almost not affected by ENO1 over-expression.

本研究結果顯示全長ENO1蛋白本身具有抑制EMT的效應。為了排除MBP-1的干擾，我們構建了在ATG密碼子處不產生選擇性翻譯MBP-1的突變型ENO1，并檢測到過表達野生型ENO1和突變型ENO1在蛋白水平上對EMT相關分子標志物的改變作用幾乎完全相同。而MBP-1對ERK信號通路的影響，則需要進一步的實驗驗證。

圖 4 野生型和點突變ENO1具有相同作用。A：序列比對發現ENO1突變型存在兩個ATG→CTG；B：Western blot檢測顯示出瞬時過表達野生型和突變型ENO1對E-cadherin、N-cadherin、p-ERK1/2變化影響是相似的。Fig 4 Wild type and point mutant ENO1 have the same effect.A: Sequence comparison: two point mutation ATG-＞CTG existed in mutant ENO1; B: Western blot assay: highly similar effect on E-cadherin, N-cadherin and p-ERK1/2 appeared after transient overexpression of wild type and mutant ENO1 in A549.

本研究不僅初步證實了ENO1的多功能性，為“糖酵解相關酶是多功能蛋白”的理論提供了新證據，而且也從影響細胞內信號傳導的角度揭示ENO1抑制EMT的分子機理。經典的MAPK通路涉及到了Raf1→MEK1/2→ERK1/2的信號傳遞和放大過程[24]，磷酸化的ERK1/2激活轉錄因子c-Jun和c-Fos表達，進而促進MMP-2等基因表達，降解胞外基質，促進細胞運動[25]。當細胞接受MEK1/2特異性抑制劑U0126處理后，ERK1/2信號通路被阻斷，弱化TGFβ誘導EMT的效果，表明ERK1/2通路的活化是細胞EMT過程的一個必要條件[7]。ERK1/2的第204/187位酪氨酸殘基和MEK1/2第218/222位絲氨酸殘基的磷酸化，分別指示了這兩種激酶的活化狀態，并且MEK1/2是目前已知唯一能夠活化ERK1/2的激酶[26,27]。基于這些條件，本實驗分析了ENO1的過表達對ERK1/2信號通路的影響，進而發現了一個有趣的現象，即ENO1過表達引起活性狀態的ERK1/2降低，而不影響MEK1/2活化。在另外一個研究[18]中，研究人員發現前列腺癌細胞中MBP-1可以通過同MEK5的直接相互作用抑制MEK5/BMK1的非經典MAPK信號通路。因此，我們推測在ERK1/2磷酸化/去磷酸化調節過程中，ENO1可能通過某種機制抑制了MEK1/2的催化活性，但不會影響MEK1/2的活化；也有可能是ENO1過表達，增強了PTPs和MKPs等磷酸酶活性，但這些推論需要更多的實驗證據來支持。