MALDI-TOF質譜篩查NSCLC患者血清特異性多肽的探索性研究

安娟 湯傳昊 王娜 劉毅 郭萬峰 李曉燕 王子赫 何昆 劉曉晴

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率上升速度高居各種腫瘤之首。據衛生部2008年統計數據顯示，我國每年肺癌的發病人數約為70萬，2/3的患者發現時已失去手術根治機會。其中，占肺癌80%-90%的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者5年生存率僅為8%-15%[1]，但I期肺癌術后10年生存率可達到92%[2]。由此可見早診斷早治療是降低肺癌死亡率的關鍵所在。傳統的醫學診斷主要通過影像學檢查，盡管低劑量螺旋CT的應用相比胸部X線片提高了肺癌早診率，死亡率下降了20%[3]，然而，早期肺癌患者體內潛在癌變的細胞克隆遠遠小于現今影像學測量技術可達的最小閾值，因此有必要尋找更早于影像學診斷的靈敏性和特異性更高的方法以提高肺癌的早期確診率。腫瘤蛋白質組學從蛋白、肽段等更微觀的角度研究腫瘤，尋找腫瘤標志蛋白，進而闡明其表達水平的變化與腫瘤發生、發展的相互關系，在腫瘤早期診斷中極具潛力。其核心技術質譜分析近年已逐漸應用于乳腺癌、胃癌、大腸癌等惡性腫瘤早期診斷的探索性研究[4-6]。本研究旨在應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionizationtime of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）與納米磁珠提取血清多肽方法相結合--ClinProtTM系統，探索性分析NSCLC患者與健康人群的血清，從中篩選差異性多肽，通過統計學方法建立診斷NSCLC的分類模型并進行驗證，以期為建立NSCLC血清學診斷方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源與收集 共收集了2011年8月-2012年10月在軍事醫學科學院附屬醫院肺部腫瘤科就診，經病理證實為NSCLC的患者的血清標本（以下簡稱肺癌組）133例，所有病例均經臨床檢查排除重要臟器（心、肝、腎等）疾病，血清標本在患者未進行任何治療時采集。同期收集了來自門診體檢正常的健康者的血清標本（以下簡稱健康組）132例，所有健康者肺部專科檢查無異常，既往無肺部疾病病史。

標本收集步驟：①晨起8:00空腹采集外周靜脈全血3 mL置于EDTA抗凝試管；②常溫靜置2 h；③于4oC、1,500 r/min離心10 min；④取上清液（血清），每150 μL分裝一份，-80oC冰箱保存。

1.1.2 入組者基本情況 將133例NSCLC患者和132例健康者血清標本分別按3:1的比例隨機分為兩組：訓練組由100例NSCLC患者（以下簡稱肺癌組I）和100例健康者（以下簡稱健康組I）血清標本組成，用以建立分類模型；測試組由33例NSCLC患者（以下簡稱肺癌組II）和32例健康者（以下簡稱健康組II）血清標本組成，用以驗證模型。訓練組與測試組患者在年齡、性別、吸煙情況、組織學類型及臨床分期等方面均無統計學差異。患者及健康者基本情況見表1。

1.1.3 試劑和儀器 三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）（美國Sigma公司）；乙腈（acetonitrile，CAN，美國Fisher公司）；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA）和混合標肽（Bruker公司）；銅離子螯合納米磁珠（MB-IMAC-Cu2+）及其緩沖液體系（國家生物醫學分析中心）；MALDI-TOF-MS（Ultraflex）、 MTP-Anchorpchip 靶（Var/384）、磁珠分離器（magnetic bead separator, MBS）、分析軟件ClinProTools 2.1均為Bruker公司產品；離心機（LDZ5-2，北京離心機廠）。

表 1 患者及健康者基本情況Tab 1 Basic information of patients and healthy human

1.2 磁珠提取血清多肽及質譜檢測 將MB-IMAC-Cu2+混勻，取5 μL磁珠及50 μL結合液加入Eppendorf管，放在MBS上移動4次，棄去上清液，并重復3次；再加入20 μL結合液和 5 μL血清，混勻，室溫下靜置10 min，編號；將Eppendorf管放在MBS上移動4次，除去上清液；加入100 μL洗滌液，在MBS上移動4次，棄去上清液；再加入100 μL洗滌液，在MBS上移動4次，棄去上清液，此步驟重復2次；加入20 μL洗脫液，混勻，室溫靜置20 min，將Eppendorf管放置在MBS上移動4次后靜置20 s，將上清液移至新的Eppendorf管內，得到血清多肽，編號。

將1 μL提取的血清多肽與1 μL飽和HCCA基質（用含0.1%TFA、50%CAN溶解）混勻，點在靶板上，室溫干燥；將靶板放入質譜儀； 用標準品校正儀器后，檢測標品，獲得由不同質荷比（mass-to-charge ratio, m/z）的多肽峰構成的質譜圖。

為了避免系統誤差以及人為操作的失誤，在每次標本檢測前均會使用標準品（多肽混合物）進行檢測，當檢測結果與標準品組成一致，說明試驗系統正常時才會進行標本的檢測，從而保證實驗結果可靠以及可重復性。

同時，為了說明系統穩定性，隨機抽取肺癌組和健康組血清標本各10例，每例每一次取血清5 μL，用于連續6天以及1天內連續6次的磁珠提取和質譜實驗。選取m/z范圍在1,000 Da-10,000 Da的峰計算變異系數，結果顯示日間和日內變異系數均小于20%。

1.3 統計學分析 血清多肽經MB-IMAC-Cu2+提取后，通過MALDI-TOF-MS進行線性模式檢測，所獲得的質譜數據通過 ClinProToolTM（CPT）軟件進行統計學分析，在用CPT軟件正式分析前先對樣品原始質譜圖進行處理，包括基線消減、校正和歸一化。隨后，將作為訓練組的100例NSCLC患者和100例健康者的血清多肽譜，用軟件內嵌的統計算法進行統計學分析，獲得兩組間的差異表達多肽，然后由統計軟件優選出其中3個多肽（7,478.59 Da、2,271.44 Da、4,468.38 Da）建立診斷NSCLC的分類模型。模型通過分析這3個多肽在每例標本中的峰面積大小，判斷該標本來源于肺癌患者或健康者。最后再用測試組的33例NSCLC患者和32例健康者通過分類模型進行盲樣驗證，以檢驗模型的穩定性和可靠性。

2 結果

2.1 訓練組的血清多肽指紋圖譜 訓練組納入100例NSCLC患者和100例健康者，應用MALDI-TOF-MS技術檢測訓練組的血清多肽磁珠提取物，得到肺癌組I和健康組I的血清多肽指紋圖譜，結果見圖1。

2.2 訓練組的血清差異多肽結果分析

2.2.1 肺癌相關差異表達多肽的發現 肺癌組I和健康組I的血清多肽指紋圖譜經CPT軟件分析后共鑒定出多肽峰131個。定義兩組間P＜0.000,001、AUC≥0.9的多肽峰具有統計學差異，由此找到兩組m/z在1,000 Da-10,000 Da范圍內表達的差異多肽峰14個，具體結果見表2。

表 2 訓練組差異多肽質荷比及表達變化Tab 2 m/z and expression change of training group

2.2.2 NSCLC分類模型的建立 通過CPT軟件的聚類分析方法（圖2）對肺癌組I與健康組I的血清多肽指紋圖譜進行對比分析，得到監督神經網絡算法（supervised neural network, SNN）為最優算法，該算法是以原型為基礎的分組算法，是以Kohonen’s學習型向量量化器的觀點為基礎，從監督相關的神經氣體算法[7]改進而來。其工作方式為：①依據Batch-Neural-Gas算法將預先定義的原型（分組）數分布于數據中，進而根據數據密度屬性建立原型的最優分布；②隨后根據分組信息優化原型數在數據中的分布，同時將經驗性錯誤最小化。該算法結果顯示最優模版由3個多肽組成，其質荷比分別為7,478.59 Da、4,468.38 Da、2,271.44 Da（圖3）。以該模版建立分類模型，定義當某血清多肽圖中其7,478.59 Da峰面積在（3.85±1.42）范圍、4,468.38 Da峰面積在（434.41±157.85）范圍、2,271.44 Da峰面積在（12.01±4.28）范圍時，該血清來源于肺癌患者；而血清多肽圖中7,478.59 Da峰面積在（11.55±3.78）范圍、4,468.38 Da峰面積在（150.05±51.41）范圍、2,271.44 Da峰面積在（37.7±23.8）范圍時，該血清來源于健康者。結果得到該模型對肺癌的識別率為98.04%，預測能力為99.07%。

2.3 盲法鑒定 對納入測試組的33例肺癌患者和32例健康者血清，采取同樣的CPT軟件獲得其血清多肽指紋圖譜，并運用SNN算法建立的模型進行驗證，33例肺癌患者和31例健康對照被準確判斷（其中33例肺癌患者全部判斷正確，32例健康者中有1例判斷假陽性，其它都判斷正確）。通過盲樣驗證，該模型的準確率為98.5%，特異性為96.9%，敏感性為100%。

3 討論

質譜分析是腫瘤蛋白質組學的核心檢測技術，目前常用的生物質譜包括： MALDI-TOF-MS、電噴霧質譜（electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS）、表面加強激光解析電離飛行時間質譜（surface-enhanced laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, SELDITOF-MS）等。其中MOLID-TOF-MS具有耐鹽和耐污染物的能力高、靈敏度高的特點，在儀器中引入反射技術和延遲提取技術后，儀器的分辨率大大提高，在測定2,000 Da左右的小分子多肽時，準確度可達到 10 ppm以下。

圖 1 訓練組的血清多肽圖譜。A：肺癌組I；B：健康組I。Fig 1 Serum peptide profiles of training group. A: NSCLC I; B: Healthy I.

圖 2 血清多肽圖的聚類分析（紅色：肺癌組I；綠色：健康組I）Fig 2 Clustering analysis of MS-based serum peptide profiles (red:NSCLC I; green: Healthy I)

圖 3 建模的3個多肽峰（紅色：肺癌組I；綠色：健康組I）Fig 3 Specific peptide peaks of model (red: NSCLC I;green: Healthy I)

鑒于質譜在鑒定蛋白質方面具有高敏感、高通量等優勢，近年來很多研究者嘗試通過質譜檢測來早期診斷腫瘤。其主要方法是通過對腫瘤患者與健康人群的標本進行質譜分析，從而發現腫瘤特異性蛋白或多肽。Monari等[8]用IMAC30-Cu和H50的SELDI芯片對44例NSCLC患者和19例正常人研究，發現兩組間存在28個明顯差異峰，遂建立模型，用IMAC30-Cu芯片得到的敏感性和特異性分別是70.45%和68.42%，而H50芯片分別是72.73%和73.68%。Han等[9]用金屬親和蛋白芯片和SELDITOF技術研究血清標本，利用3個蛋白質建立樹狀模型，盲樣驗證敏感性為89%、特異性為91%、準確率為90%。Hocker等[10]采用ESI-MS對43例早期NSCLC患者和21例對照者的血清標本進行分析，鑒定的差異蛋白區分患者及健康者血清的總體有效率和靈敏度為80%和84%。這些研究結果說明質譜檢測方法有能力識別肺癌患者血清里所含有的腫瘤相關信息，有可能進行肺癌的早期診斷。但上述研究盲樣驗證的敏感性和特異性均較低，且沒有后續研究進一步驗證。分析其原因為：①在傳統的方法中，無論是雙向凝膠電泳、蛋白芯片還是固相萃取小柱等預處理技術提取標本中的蛋白和多肽，均存在操作復雜且提取效率較低的缺點，導致可用信息丟失；②ESI、SELDI-TOF-MS等質譜檢測方法靈敏度和分辨率較低，反映的信息較少。以上限制阻礙了它們在疾病特異性標志物的發現和臨床診斷上的應用。

為了解決上述問題，本研究組應用了德國布魯克·道爾頓公司研發的ClinProtTM檢測系統[11,12]。它包括磁珠分離系統、MALDI-TOF-MS系統、分析軟件和可選的體液樣品自動處理系統，其優勢在于：①擁有最新Anchor-Chip專利技術的樣品靶可大大增加分析物的濃度，較常規芯片提高10倍-100倍的靈敏度；②MALDI技術的分辨率與重復性、重現性均高于SELDI或其它質譜技術；③液體磁珠總表面積大，能充分捕獲血清中特異低豐度多肽信息，提高了模型的特異性和準確性；④水熱法制備金屬螯合納米磁珠[13]系統配合了一套適合于質譜分析的緩沖溶液，整個實驗體系穩定、可靠，實現了樣品微量化，分析過程快速化、通量化、標準化。在哈佛大學女子醫院、紐約斯隆-凱特琳癌癥研究所、貝勒醫學院等世界一流醫院和醫學研究所中，該技術已廣泛應用于卵巢癌、腦膠質瘤、頭頸鱗癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌[14,15]等的早期診斷研究中，而在本研究中，我們通過ClinProtTM檢測系統對NSCLC患者和健康者血清進行了檢測，兩組間發現14個有統計學差異的多肽峰，遂以統計軟件篩選出3個多肽峰建立NSCLC分類模型，并對其進行盲樣驗證，其敏感性為100%，特異性為96.9%，準確率為98.5%，說明我們建立的分類模型理論上具有一定的鑒別NSCLC患者的價值，但尚需在臨床實踐中進一步證實。

關于我們建立的分類模型，它不像傳統診斷模式那樣以單一指標為判斷依據，而是以一組多肽指標為判斷標準。它以生物質譜技術為支撐平臺，生物信息學為橋梁，對多肽表達進行研究，通過肺癌患者血液中多肽組的變化，可以發現特異的腫瘤相關信息以達到對腫瘤的診斷。當血液流經腫瘤微環境時，血清蛋白/多肽組中可能產生許多輕微的未知組分的變化，因此，使用復合的標志物可以較單個標志物更為有效。通過MALDI-TOF分析的血清質譜圖需要數字化并經成熟的生物信息工具軟件來診斷分析，通過與機體在正常條件下的質譜圖進行比較，從而鑒別腫瘤患者和非腫瘤患者。它可在數分鐘內從微量血液中測出上萬個結果并對其進行分析，理論上這種分類模型在腫瘤診斷中有望超越傳統的標志物檢測。

本研究中建立分類模型的3個多肽峰，數據庫檢索顯示其中m/z為2,271.44的多肽峰可能代表間α胰蛋白酶重鏈H4（inter-α-trypsin inhibitor H4, ITIH4）。查閱文獻，間α胰蛋白酶重鏈（inter-α-trypsin inhibitor, ITIH）基因是一種抑癌基因[16]，包括ITIH1-ITIH5，其中ITIH4定位于3號染色體短臂，對血漿激肽釋放酶高度敏感，被認為是潛在的血漿激肽釋放酶誘導的生物肽前體。它主要在炎癥和癌癥發生方面起重要作用[17]。有研究[18]發現ITIH4在卵巢癌血清中表達下降。也有研究[19,20]認為ITIH4是乳腺癌的腫瘤標志物，在乳腺癌患者血清中表達上調，有助于診斷和判斷預后 。但有關肺癌的報道較少，Hamm等[17]發現在52%的肺癌組織中ITIH4 mRNA表達量下降。本研究結果亦顯示在血清多肽圖譜中該多肽峰表達下調，其在肺癌發生發展中的具體作用機制及其作為診斷標志物的價值還有待進一步研究。

本研究選用NSCLC患者以及健康者的血清作為研究對象，應用ClinProtTM系統的MALDI-TOF-MS技術檢測血清多肽，對特異的NSCLC相關多肽小規模驗證，得到了相對較高的敏感性和特異性。由于我們收集的標本主要來源于IV期患者且多為腺癌患者，以后將納入更多的I期患者標本甚至動態監測高危人群的標本，以及鱗癌等其它組織學類型的NSCLC標本，進一步驗證該診斷模型的敏感性和特異性。用于NSCLC診斷的特異血清多肽譜模型，具有無創、標本量需求少、簡便、快捷、準確性高等優勢，下一步我們需要在臨床實際工作中進行大規模驗證，希望為建立NSCLC血清學診斷方法奠定基礎。