反膠束萃取技術(shù)及其在植物蛋白質(zhì)提取中的應(yīng)用研究進(jìn)展

郭 珍 陳復(fù)生 李彥磊 李潤潔

（河南工業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450001）

反膠束萃取技術(shù)是繼雙水相萃取之后的一種適合生物大分子分離純化的新型分離技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)在食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)［1］，甚至納米材料［2，3］的制備上得到了廣泛的研究。尤其是在植物蛋白質(zhì)的提取上，與傳統(tǒng)的堿溶酸沉法相比，不僅具有成本低，可連續(xù)性操作等優(yōu)點(diǎn)，而且反應(yīng)條件溫和，形成的反膠束對活性物質(zhì)具有一定保護(hù)作用，因此可以減少蛋白質(zhì)活性損失［4，5］。

1 反膠束萃取的基本概念

1.1 反膠束萃取的概念

1943年Hoar等［6］報(bào)道了反膠束的存在，反膠束是指表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定和光學(xué)透明的納米級聚集體。

反膠束中表面活性劑的非極性端朝外指向有機(jī)溶劑，極性端朝內(nèi)聚集增溶一部分水形成“水池”，該“水池”具有增溶蛋白質(zhì)的能力，從而實(shí)現(xiàn)植物蛋白的萃?。?］。表面活性劑分子層可以避免蛋白質(zhì)與有機(jī)溶劑接觸，從而保持蛋白質(zhì)活性。構(gòu)成反膠束的表面活性劑最好是具有空間體積較大的疏水基團(tuán)和體積較小的親水基團(tuán)，例如最常用的順－二－（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸鈉（AOT）［8］。

1.2 體系表征參數(shù)

表征反膠束體系的參數(shù)有W0（水與表面活性劑的摩爾比）、θ（增容水相對總體積的濃度）、N（組成反膠束微粒的表面活性劑的個(gè)數(shù)即聚集數(shù)），其中W0最為常用［9］。高亞輝［10］在研究中發(fā)現(xiàn)W0對反膠束體系的黏度，“水池”直徑，聚集數(shù)以及單個(gè)表面活性劑所占面積都有很大的影響，從而進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的提取率。Lichun等［11］認(rèn)為，隨著W0增加，更多的水與表面活性劑形成結(jié)合水從而增加萃取率，而W0繼續(xù)增加，增加的自由水則對萃取率沒有貢獻(xiàn)。

1.3 反膠束萃取植物蛋白的機(jī)理

對反膠束萃取蛋白質(zhì)的研究已有30～40年，但對萃取過程中傳質(zhì)機(jī)理研究并不多。通常認(rèn)為反膠束是通過表面活性劑極性端和蛋白質(zhì)之間的靜電作用力實(shí)現(xiàn)萃取的［12］，但一些學(xué)者［13－15］相繼提出疏水相互作用、離子對溶解機(jī)理、離子交換機(jī)理等，蛋白質(zhì)在反膠束中實(shí)現(xiàn)萃取或許是多種作用力共同作用的結(jié)果。反膠束體系處于一種動(dòng)力學(xué)平衡狀態(tài)，相互之間不斷碰撞，而且經(jīng)常交換內(nèi)核所含物質(zhì)，大約1 000次的碰撞就會(huì)導(dǎo)致反膠束間交換所含的物質(zhì)一次，這些交換發(fā)生在10－3s的時(shí)間范圍內(nèi)，而碰撞發(fā)生在10－6s的時(shí)間范圍內(nèi)，反膠束間交換物質(zhì)是非常頻繁的［16］。

植物蛋白質(zhì)可通過注入法、固溶法和相轉(zhuǎn)移法進(jìn)入反膠束溶液中，對于注入法以及固溶法，普遍認(rèn)為反膠束是通過直接與蛋白質(zhì)分子在兩相界面發(fā)生作用來完成質(zhì)量轉(zhuǎn)移的，同時(shí)還伴隨有水和離子的增溶［17］。而對于相轉(zhuǎn)移法，大多數(shù)人認(rèn)為蛋白質(zhì)是通過與游離的表面活性劑發(fā)生作用形成蛋白質(zhì)－雙親物質(zhì)復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)傳質(zhì)［17］。蛋白質(zhì)在兩相（有機(jī)相和水相）間的傳遞過程可分為三步，① 蛋白質(zhì)從水溶液中擴(kuò)散到兩相界面；② 蛋白質(zhì)在界面處形成包容蛋白質(zhì)的反膠束；③ 包容蛋白質(zhì)的反膠束擴(kuò)散在有機(jī)相中［18］，蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠束有機(jī)相的傳遞通量可以用式（1）計(jì)算：

式中：

Kf——為萃取過程表觀傳質(zhì)系數(shù)；

CW—— 水相中蛋白質(zhì)濃度，mol／L；

C0—— 有機(jī)相中蛋白質(zhì)濃度，mol／L；

m——萃取的分配系數(shù)。

反膠束萃取植物蛋白的多少主要取決于水相條件，如pH，離子強(qiáng)度以及電解質(zhì)種類，通過改變與蛋白質(zhì)之間的相互作用來影響蛋白質(zhì)在“水池”中的溶解度，同時(shí)還受表面活性劑的種類以及濃度的影響。不同的反應(yīng)條件使得提取出的蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)也有所不同［19］。

2 反膠束萃取技術(shù)在植物蛋白質(zhì)提取中的應(yīng)用研究

反膠束萃取技術(shù)將提純與濃縮集于一個(gè)過程，可以高效節(jié)能地從復(fù)雜的體系中分離純化出目標(biāo)蛋白并保持其生物活性。

2.1 植物蛋白的分離

蛋白質(zhì)在不同植物中的存在狀態(tài)以及性質(zhì)有著很大的差別［20，21］，因此，在利用反膠束萃取技術(shù)進(jìn)行分離時(shí)需要適當(dāng)調(diào)節(jié)體系參數(shù)（如pH、溫度等），探索最優(yōu)工藝，從而獲得較高的萃取率［22］。

根據(jù)文獻(xiàn)［23］，反膠束法萃取脫脂玉米胚芽時(shí)，在胚芽粉加入量為0.75g、AOT濃度0.044g／mL、pH 值7.17、溫度38℃的條件下，萃取率達(dá)到最大58.36%；而在脫皮麥胚蛋白的后萃試驗(yàn)中［24］，pH 為9.47，KCl濃度為0.611mol／L時(shí)達(dá)到最高萃取率80%，與傳統(tǒng)方法（堿溶酸沉法）相比有很大提高。同時(shí)，郭紅珍［25］對杏仁中蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝進(jìn)行試驗(yàn)，獲取了最佳條件：W0值為40，pH值7.0，溫度25℃，時(shí)間90min，Xihong等［26］也利用反膠束體系成功地從大豆中提取出蛋白質(zhì)，最終確定了最佳提取工藝：AOT濃度為120mmoL／L，pH值為5.5，KCl濃度為0.8mol／L。

綜上所述，反膠束萃取不同的植物蛋白（麥胚蛋白，杏仁蛋白，大豆蛋白）所需的最優(yōu)條件不同，這為今后反膠束萃取植物蛋白的大規(guī)模應(yīng)用提供了可靠的數(shù)據(jù)信息。

2.2 植物油脂和蛋白質(zhì)的同時(shí)分離

傳統(tǒng)堿溶酸沉法提取蛋白質(zhì)，不僅工藝復(fù)雜，而且消耗大量酸堿引起環(huán)境污染，同時(shí)易引起蛋白質(zhì)變性。而反膠束技術(shù)一方面通過“水池”實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)保護(hù)，另一方面體系中有機(jī)溶劑同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對油脂的分離［9］。

Leser等［27］利用 AOT／異辛烷體系，通過調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，表面活性劑濃度，pH值，成功的從大豆和向日葵中提取出油和蛋白質(zhì)，該研究證明了利用反膠束萃取技術(shù)來分離蛋白和油是可行的，并且工藝簡單。趙俊廷等［28］實(shí)現(xiàn)了AOT／異辛烷反膠束體系同時(shí)萃取分離植物油中蛋白質(zhì)和油脂，同時(shí)得到蛋白質(zhì)最佳萃取條件：萃取時(shí)間90min、KCl濃度0.10mol／L、pH值5.5、AOT／異辛烷濃度0.16g／mL；最佳后萃取條件：萃取時(shí)間90min、KCl濃度1.20mol／L、pH 值7.7。李飛等［29］采用AOT反膠束萃取體系實(shí)現(xiàn)了玉米胚芽中的蛋白質(zhì)和油脂的同時(shí)分離。在萃取時(shí)間1.0h，W0值25，萃取溫度40℃，pH值7，離子強(qiáng)度0.1mol／L，加樣量0.5g的最優(yōu)條件下，油脂的提取率達(dá)85.49%，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)45.61%。陳復(fù)生等［30］對反膠束技術(shù)同時(shí)提取花生蛋白和油脂的技術(shù)研究進(jìn)行了報(bào)道，獲取了最佳工藝條件，此后又對蛋白酶對萃取過程的影響進(jìn)行了研究［31］。

2.3 反膠束萃取植物蛋白技術(shù)的優(yōu)化研究

反膠束技術(shù)與超聲波技術(shù)聯(lián)用，不僅超聲的空化作用以及機(jī)械粉碎作用可以增加植物蛋白在反膠束中的萃取率［32，33］，而且，萃取得到的蛋白質(zhì)與未聯(lián)用超聲技術(shù)、傳統(tǒng)堿溶酸沉法提取的蛋白質(zhì)相比持水性、起泡性、起泡穩(wěn)定性及乳化穩(wěn)定性更優(yōu)［34］。

丁皓等［35］提出了一種新型反膠束水合萃取技術(shù)，將反膠束萃取和水合物生成耦合在一起，實(shí)現(xiàn)了藻藍(lán)蛋白的萃取及純化，為進(jìn)一步開展水合物法生物活性控制及反膠束水合萃取技術(shù)的研究提供了依據(jù)。Li Yingnan等［36］提出采用高速逆流色譜（HSCCC）與反膠束技術(shù)聯(lián)用，從苦瓜中分離出3種蛋白質(zhì)，其中2種蛋白質(zhì)有類似P－beta抗體作用，另外一種與NCBInr數(shù)據(jù)庫比對未鑒定出，但通過試驗(yàn)驗(yàn)證具有較高的抗癌作用。

這些研究成果表明反膠束技術(shù)可以通過與其它技術(shù)結(jié)合來提高萃取率并保護(hù)蛋白質(zhì)活性，這為反膠束技術(shù)的進(jìn)一步完善以及在生物活性物質(zhì)上提取提出了新的指導(dǎo)方向。

3 結(jié)論

反膠束技術(shù)在分離提純植物蛋白質(zhì)方面表現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢，不僅得率高可實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，而且提取的蛋白質(zhì)具有較高的生物活性。但是，反膠束技術(shù)還處于研究階段，尚存在一些問題，未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)：① 反膠束體系可用不多，表面活性劑溶解性不是很好；② 反膠束萃取后表面活性劑的殘留；③ 反膠束“水池”大小的限制，使得萃取出大多為小分子蛋白；④ 反膠束萃取蛋白的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)機(jī)理尚不明確。

如果能夠嘗試合成一些優(yōu)良表面活性劑，并對萃取過程進(jìn)行深層次的研究，為工業(yè)化生產(chǎn)積累所需數(shù)據(jù)，反膠束萃取技術(shù)將會(huì)在植物蛋白及油脂的提取上實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，屆時(shí)將會(huì)引起食品工業(yè)深刻而廣泛的變革。

1 Siti H M，Hanapi M，Siti N M.Kinetic study of antibiotic by reverse micelle extraction technique［J］.Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2012，43（5）：1～5.

2 Kafshgari M H，Khorram M，Mansouri M，et al.Preparation of alginate and chitosan nanoparticles using a new reverse micellar system［J］.Iran Polym J.，2012，21（2）：99～107.

3 杜晶，付云芝，李津.反膠束體系制備高度單分散、小粒徑量子點(diǎn)的研究進(jìn)展［J］.化工文摘，2009（3）：59～62.

4 Zhu K X，Sun X H，Chen Z C.Comparison of functional properties and secondary structures of defatted wheat germ proteins separated by reverse micelles and alkaline extraction and isoelectric precipitation［J］.Food Chemistry，2010（4）：1 163～1 169.

5 Zhou B，Wan J F，Wang J Z.Effect of chaotropes in reverse micellar extraction of kallikrein［J］.Process Biochemistry，2012，47（2）：229～233.

6 Hoar T P，Schulman J H.Transparent water in oil dispersions：the oleopathic hydromicelle［J］.Nature，1943（102）：85～112.

7 陳復(fù)生，程小麗，李里特，等.反膠束萃取大豆蛋白過程中動(dòng)力學(xué)的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2010，25（5）：24～28.

8 孫曉宏.反膠束法萃取小麥胚芽蛋白的研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2008.

9 段海霞，曹勁松，彭志英.反膠束萃取技術(shù)在食品中的研究應(yīng)用進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（5）：90～91.

10 高亞輝.黏度法對AOT／異辛烷反膠束體系的研究［J］.中國油脂，2007，32（9）：46～48.

11 Dong L C，Huang S J，Luo Q，et al.Glutathione extraction and mass transfer indi－（2－ethylhexyl）ammonium phosphate／octanol reverse micelles［J］.Biochemical Engineering Journal，2009，46（2）：210～216.

12 Marcozzi G，Correa N，Luisi P L，et al.Protein extraction by rev－erse micelles：a study of the factors affecting the forward and b－ackward transfer ofα－chymotrypsin and its activity［J］.Biotechnol.Bioeng.，1991（38）：1 239～1 246.

13 Zhao X Y，Chen J，Lu Z F，et al.Analysis of the amino acids of soy globulins by AOT reverse micelles and aqueous buffer［J］.Appl Biochem.Biotechnol.，2011（165）：802～813.

14 Murakami H，Toyota Y，Nishi T，et al.Terahertz absorption spectroscopy of protein－containing reverse micellar solution［J］.Chemical Physics Letters，2012（519）：105～109.

15 高亞輝，陳復(fù)生，張書霞，等.反膠束萃取大豆蛋白前萃過程機(jī)理初探［J］.食品與機(jī)械，2009，25（5）：68～70.

16 劉會(huì)洲.微乳相萃取技術(shù)及應(yīng)用［M］.北京：科學(xué)出版社，2005：154.

17 Paradkar V M，Dordick J S.Extraction and solubilization of chymotrypsin into isooctane in the presence of low concentrations of aerosol OT in the absence of reverse micelles［J］.Biotechnology and Bioengineering，1994，43（6）：529～540.

18 張潔.反膠束體系及其對大豆蛋白的萃取研究［D］.鄭州：河南工業(yè)大學(xué)，2007.

19 陳復(fù)生，程小麗，李里特.不同萃取方法對大豆分離蛋白功能特性的影響研究［J］.中國食品添加劑，2009（6）：131～135

20 孫敬，董賽男.食品中蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)－大豆蛋白和小麥蛋白［J］.肉類研究，2009（9）：70～79.

21 吳海文，王強(qiáng)，周素梅.花生蛋白及其功能性研究進(jìn)展［J］.中國油脂，2007，32（9）：7～10.

22 李潤霞，陳復(fù)生，趙俊廷.反膠束萃取技術(shù)在食品中的應(yīng)用研究［J］.食品與機(jī)械，2006，22（5）：115～119.

23 任健，徐慧.反膠束法前萃取玉米胚芽蛋白的工藝條件優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械，2012（3）：64～66.

24 Sun X H，Zhu K X，Zhou H M.Optimization of a novel backward extraction of defatted wheat germ protein from reverse micelles［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10（3）：328～333.

25 郭紅珍.反膠束溶液萃取杏仁蛋白前萃工藝的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2011，26（1）：106～108.

26 Zano X H，Li Y M，He X W.Study of the factors affecting the extraction of soybean protein by reverse micelles［J］.Mol.Biol.Rep.，2010，37（2）：669～675.

27 Leser M E，Kkstina R，Luide P.The use of reverse micelles for the simultaneous extraction of oil and protein from vegetable meal［J］.Biotechnol Bioeng，1989，34（11）：1 140～1 146.

28 趙俊延，王興國.利用反膠束溶液同時(shí)萃取油料中的油和蛋白質(zhì)的研究［D］.無錫：無錫輕工業(yè)大學(xué)，2001.

29 李飛，朱科學(xué)，周惠明，等.反膠束法同時(shí)提取玉米胚芽中蛋白質(zhì)和油脂的前萃工藝研究［J］.中國油脂，2009，34（11）：27～30.

30 陳復(fù)生，趙俊廷，委源功.利用反膠束萃取技術(shù)同時(shí)分離植物蛋白和油脂［J］.食品科學(xué)，1997，18（8）：43～46

31 楊宏順.反膠束酶活性及其對植物蛋白和油脂分離影響的研究［D］.鄭州：鄭州工程學(xué)院，2002.

32 劉海遠(yuǎn)，布冠好，陳復(fù)生，等.超聲波輔助CTAB反膠束萃取大豆蛋白的研究［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械，2011（20）：68～71.

33 陳復(fù)生，程小麗，李里特.不同萃取方法對大豆分離蛋白功能特性的影響研究［J］.中國食品添加劑，2009（6）：131～135.

34 程小麗，陳復(fù)生，李里特，等.超聲波輔助AOT反膠束后萃大豆蛋白的研究［J］.食品與機(jī)械，2009，25（5）：71～74.

35 丁皓，裘俊紅.反膠束水合萃取藻藍(lán)蛋白研究［J］.浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39（4）：372～375.

36 Li Y N，Yin L H，Zheng L L，et al.Application of high－speed counter－current chromatography coupled with a reverse micelle solvent system to separate three proteins from Momordica charantia［J］.Journal of Chromatography B，2012（895～896）：77～82.