木醋桿菌分批補料發酵法生產廣式米醋

傅 亮 易九龍 陳思謙 吳炳鴻

（1.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.廣州市如豐果子調味食品有限公司，廣東 廣州 511330）

傳統的廣式米醋通常以米酒及食用酒精為原料，以木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）作為主要產酸菌，采用表面靜止發酵法生產［1］。發酵周期一般為40d以上，發酵總酸在3.5～4.5g／100mL，業內普遍認為廣式米醋的發展應縮短發酵時間，提高發酵酸度。生產實踐中發現，采用分批補料發酵法生產的廣式米醋總酸，高于單批發酵總酸度。武斌等［2］研究也表明，以巴氏醋桿菌為菌種采用分批發酵法能明顯提高醋酸度和乙醇轉化率，縮短生產周期，節約成本。

本試驗采用廣州如豐果子調味食品有限公司在發酵車間分離的木醋桿菌菌株RF4作為發酵菌種，研究發酵總酸的變化規律，比較發酵過程中纖維素膜內與發酵液中菌體數的差異，探討最適原料酒精度，并研究通過在發酵過程中采用分批補料法提高總酸的可行性并進行工藝參數的優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

菌種：自廣州如豐果子調味食品有限公司米醋生產車間分離出的主要產酸菌RF4，經16SrDNA鑒定為葡糖醋桿菌屬的木醋桿菌 （Gluconacetobacter xylinus）［3］；

纖維素酶：酶活18 391U／g，美國Sigma公司；

乙醇、碳酸鈣、氫氧化鈉等：分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：HR－120型，上海精密科學儀器有限公司；

高壓蒸汽滅菌器：YQX－SG46－280S型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

超凈工作臺：SW－CJ－1BU型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

生化培養箱：PYX－190－A型，上海躍進醫療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種及培養基的制備

（1）液體菌種的制備［4］：10mg／mL葡萄糖、10mg／mL酵母粉，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入5%乙醇（V／V），冷卻至室溫后接種RF4斜面菌種30℃下培養7d，菌落數測定為1.83×107CFU／mL。

（2）發酵液的制備［5］：10mg／mL葡萄糖、10mg／mL酵母粉，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入5%乙醇（V／V），冷卻至室溫后接種5% （V／V）菌種培養液，裝液量為150mL，30℃下于生化培養箱中培養。

（3）平 板 計 數 培 養 基 的 制 備［6］：10mg／mL 葡 萄 糖、10mg／mL酵 母 粉、20mg／mL 碳 酸 鈣、15mg／mL 瓊 脂，121℃滅菌20min，冷卻至70℃左右加入3%無水乙醇，制成碳酸鈣平板備用。

1.2.2 發酵總酸的測定 參照GB／T 5009.41——2003。

1.2.3 發酵液及細菌纖維素膜內木醋桿菌菌體數的測定

（1）細菌纖維素膜酶解液制備［7］：準確稱量發酵液中生成的完整濕狀細菌纖維素膜0.5g，加入0.1% （V／V）已活化好的纖維素酶溶液，用醋酸－醋酸鈉緩沖溶液調pH至5.0，蒸餾水定容至10mL，35℃水浴至膜完全崩解，得纖維素膜酶解液。

（2）平板菌落計數法［8］：以梯度稀釋法分別接種木醋桿菌發酵液和細菌纖維素膜酶解液，30℃恒溫培養96h。選取菌落周圍出現透明圈的菌落計數，根據梯度稀釋倍數計算實際菌體數。從發酵第4天開始，每3d測定1次菌落數至第16天，單位CFU／g。

1.2.4 發酵過程中補加乙醇可行性試驗與總酸測定 在發酵至第10天時補加2%（乙醇體積／發酵液體積）乙醇1次，每2d測定1次總酸，測定至第20天。

1.2.5 分批補料發酵最優條件的確定 對分批補料發酵液態發酵培養基，取每次乙醇添加量、間隔時間、開始補加時間及補加次數為因素進行四因素三水平的正交試驗，因素水平表見表1。以發酵液中總酸為指標進行因素水平的評價。以上每組試驗均做3次平行，要求誤差小于5%，取算術平均值。

2 結果與分析

2.1 發酵液和細菌纖維素膜內木醋桿菌菌落數分布比較

木醋桿菌發酵產酸過程中，細菌纖維素膜及發酵液內都存在菌體。由比較結果（表2）可知，纖維素膜內及發酵液中的木醋桿菌菌體數自發酵第4天開始顯著上升，第10天左右分別達到峰值，然后基本維持穩定，為菌體生長穩定期。隨著底物的耗盡和產物的積累，二者的菌體數在第13天時均開始下降，至第16天分別為0.98×1010CFU／g和4.00×107CFU／g，在整個發酵過程中，細菌纖維素膜內的細胞數均遠高于發酵液內的細胞數，前者在第10天時約為后者的300倍。結果表明，傳統的廣式米醋生產采用表面發酵法有利于菌體大量集中在氣液交界的膜中，有助于耗氧代謝及傳質，有利于發酵產酸，隨后的分批補料發酵也應維持細菌纖維素膜的完整性。

表1 因子水平表Table 1 Factor level table

表2 發酵液及細菌纖維素膜內木醋桿菌菌體數Table 2 Cell number of Gluconacetobacter xylinus in fermented liquid and bacterial cellulose membrane

2.2 初始酒精度對木醋桿菌發酵產酸的影響

木醋桿菌在發酵過程中，酒精濃度的高低會影響菌體的生長和代謝［8，9］。初始酒精度對產酸影響見圖1。在酒精含量為5% （V／V）時總酸可達4.2g／100mL左右，為其最適原料酒精度。

2.3 分批補料發酵提高總酸度的初步可行性

由圖2可知，不補加乙醇組在第12天左右酸度達到最大值，初步確定在第10天補加乙醇，補加乙醇組在第16天酸度達到最大值（5.35g／100mL），且遠高于不補加乙醇組。由此可見，發酵過程中補加乙醇可以提高最終總酸，通過分批補料法發酵提高廣式米醋總酸是可行的。

圖1 不同酒精含量對產酸的影響Figure 1 Total acidity under different alcohol content

圖2 單批發酵法與補料法所產總酸度比較Figure 2 Total acidity of single batch fermentation and fed－batch fermentation

2.4 補料發酵最優條件的確定及驗證實驗

正交優化試驗結果見表3。由表3可知，補料發酵過程中影響發酵產酸量的因素主次順序為A＞B＞C＞D，即乙醇添加量＞間隔時間＞開始補加時間＞補加次數，最優組合為A3B1C1D2，即每次乙醇添加3mL，占發酵液體積2%，間隔時間為2d，在發酵第6天開始補加，補加次數為3次。按照最優組合A3B1C1D2進行驗證實驗，重復5次并以單批發酵作對比，最優組合產酸量均穩定在7.29g／100mL，而單批發酵僅為4.20g／100mL。

3 結論

（1）分批補料發酵法提高廣式米醋總酸的最佳工藝為在發酵第6天開始，每隔2d添加發酵液體積2%的酒精，補加3次，最終酸度可達7.29g／100mL，較單批發酵提高了73.6%。

表3 補料發酵正交試驗結果與分析Table 3 Orthogonal experiment design and analysis of fed－batch fermentation

（2）由于木醋桿菌在發酵過程中的最適酒精度為5%（V／V），較低的酒精量導致醋酸產量低，過高的酒精含量則會抑制木醋桿菌的生長代謝，單批發酵受制于此難以生產出高酸度米醋。本試驗通過補加酒精法發酵既滿足了木醋桿菌產酸的需要，又不致于酒精度過高而抑制其生長代謝，研究結果對于生產廣式高酸米醋具有積極意義。

（3）本試驗僅以酸度為指標對分批補料發酵法的工藝進行了優化，對于如何在提高酸度的同時改善米醋其它風味品質還有待于更深入的研究。

（4）特別值得注意的是，傳統的廣式米醋發酵所用的木醋桿菌，在發酵產酸的同時會合成細菌纖維素膜漂浮于發酵液表面，與中國其它醋種發酵有顯著不同的特征。以酒精為代表的碳源，在轉化為醋酸的同時，也合成了細菌纖維素。本試驗研究表明細菌纖維素膜的存在，有助于富集大量菌體于膜內，且漂浮于發酵液表面有助于利用空氣中的氧，并進一步有助于氧化酒精轉化成乙酸。故分批補料過程中，不得破壞細菌纖維素膜。生產實踐中也發現，纖維素膜完整性的破壞，會極大降低最終制品的總酸。因此，如何在發酵過程中保持纖維素膜的完整性，如何將乙醇盡量多的轉化為乙酸，都為下一步設計高效連續生產的生化反應器、調整生產工藝提出了新的課題。

1 傅亮，陳思謙，易九龍，等.細菌纖維素膜對木醋桿菌發酵生產廣式米醋的影響［J］.食品與發酵工業，2012，38（2）：123～125.

2 武斌，李麗，趙良啟.醋酸菌培養條件的優化及醋酸分批發酵［J］.食品與藥品，2007，9（1）：11～14.

3 傅亮，易九龍，陳思謙，等.傳統廣式米醋中醋酸菌的分離與鑒定［J］.中國調味品，2012，37（6）：57～60.

4 臧晉，劉鳳霞，李永祥，等.高產醋酸菌的分離選育［J］.中國釀造，1999（5）：20～22.

5 陳義倫.優質蘋果醋釀造技術及主要風味物質研究［D］.濟南：山東農業大學，2002.

6 魏長慶，王海慶，張凌，等.葡萄果醋發酵用醋酸菌的分離及鑒定［J］.中國釀造，2010（4）：42～45.

7 賈士儒，歐竑宇，馬霞，等.細菌纖維素結構與性質的初步研究［J］.纖維素科學與技術，2002，10（3）：25～29.

8 侯小歌，杜紅陽，李學思，等.宋河大曲中醋酸菌的分離鑒定及產酸特性［J］.中國釀造，2011（4）：112～115.

9 Kiyoshi T，Tomoko A，Masahiro F，et al.Cellulose production by acetic acid－resistant Acetobacter xulinum ［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1997，84（3）：228～231.