纖維素酶輔助提取黃花蒿中青蒿素的工藝條件研究

盧婉怡

廣東省食品藥品職業技術學校制藥系，廣東廣州 510663

纖維素酶輔助提取黃花蒿中青蒿素的工藝條件研究

盧婉怡

廣東省食品藥品職業技術學校制藥系，廣東廣州 510663

目的 研究纖維素酶輔助提取青蒿素反應中各條件對提取率的影響。 方法 采用紫外分光光度法測定青蒿素含量，研究酶反應過程中時間、加酶量、溫度和pH值對提取率的影響，并使用正交實驗方法對提取工藝進行優化。結果 纖維素酶輔助提取青蒿素的最優工藝條件分別是：酶反應時間2 h，纖維素酶用量0.30 g，酶反應溫度45℃，酶反應pH值4.5。結論 纖維素酶輔助提取青蒿素的方法能夠有效提高提取率。

青蒿素；纖維素酶；提取

青蒿素（artemisinin，C15H22O5）是治療瘧疾的特效藥，具有速效、高效和低毒等抗瘧性能[1]。目前，青蒿素主要從黃花蒿（Artemisia annua L.）中提取[2]。 近年來，用于天然產物提取的新技術如微波技術、酶技術等迅速涌現，并取得顯著的成效[3]。酶技術具有反應效率高、條件溫和、專一性強和有效成分破壞少等優點[4]，受到廣泛關注。

我國是黃花蒿的主產國，將酶技術應用于青蒿素的提取過程，對提高提取效率、充分利用資源有重要意義。本研究對纖維素酶輔助提取青蒿素的條件進行研究，分析各因素對提取率的影響，并采用正交實驗的方法對酶輔助提取工藝進行優化，為纖維素酶在青蒿素提取工藝中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青蒿藥材購于廣州市清平中藥材市場（生產批號120711），經鑒定為菊科植物黃花蒿的干燥地上部分，藥材經粉碎后過40目篩備用。纖維素酶Cellulase T4（來源于綠色木霉Trichoderma viride，生產批號20120922）購自天野酶制劑（上海）有限公司。青蒿素標準品（生產批號A2118）購自百靈威科技有限公司，無水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器設備

FW135型中藥粉碎機，SHA-2型恒溫水浴振蕩器，HH-4型恒溫水浴鍋，752型紫外可見分光光度計，SHZ-D型循環水真空泵。

1.3 方法

1.3.1 纖維素酶輔助提取青蒿素的方法

稱取1 g粉碎后的青蒿樣品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，先常溫下浸泡10 min，再加入一定量的纖維素酶，然后在一定溫度下水浴振蕩進行酶反應。酶反應結束后，抽濾，將濾餅置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml無水乙醇，在45℃下水浴振蕩1 h，抽濾，取濾液測定青蒿素含量。

1.3.2 青蒿素含量的測定方法

青蒿素僅在紫外區203 nm處有較弱的末端吸收，但與堿反應后，生成一化合物Q292，該物質在292 nm處有最大吸收，可用紫外分光光度法檢測[5]。取樣品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組測定3個平行樣品，取平均值。根據標準曲線換算出青蒿素含量。

2 結果

2.1 青蒿素含量測定的標準曲線

精確稱取青蒿素標準樣品10 mg，溶于95%的乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的標準溶液。分別取標準溶液 0、1、2、3、4、5 ml， 加 95%的乙醇溶液至 5 ml，再加入 0.2%NaOH 20 ml定容至 25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組取3個平行樣品，取平均值。以青蒿素樣品濃度x（g/L）為橫坐標，292 nm吸光值y為縱坐標作圖，結果見圖1。在292 nm下，青蒿素濃度在0～1 g/L的范圍內，與吸光值呈良好的線性關系，表明測定方法準確可靠。

圖1 青蒿素含量測定標準曲線

2.2 不同酶反應時間對青蒿素提取的影響

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應，酶反應緩沖液pH值為4.5，反應時間分別為 1、2、3、4、5 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進行提取的樣品中青蒿素含量為100%進行對照，結果見圖2。隨著時間的延長，青蒿素的提取率逐漸增加，在3 h左右達到最大值，再延長提取酶反應的時間，青蒿素的提取率基本不變。

2.3 不同加酶量對青蒿素提取的影響

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4g 纖維素酶，在 45℃下水浴振蕩反應，酶反應緩沖液pH值為4.5，反應時間1 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進行提取的樣品中青蒿素含量為100%進行對照，結果見圖3。隨著酶添加量的增加，青蒿素的提取率逐漸增加，當加入0.3 g的纖維素酶時，達到最大值，再增加酶用量，青蒿素的提取率基本不變。

2.4 不同酶反應溫度對青蒿素提取的影響

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，分別在 40、45、50、55℃下水浴振蕩反應，酶反應緩沖液pH值為4.5，反應時間為1 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進行提取的樣品中青蒿素含量為100%進行對照，結果見圖4。隨著溫度的增加，青蒿素的提取率呈現先增加后減小的趨勢，在酶反應溫度為45℃時達到最大值。

圖4 不同酶反應溫度對青蒿素提取率的影響

2.5 不同酶反應pH值對青蒿素提取的影響

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應，酶反應緩沖液pH值分別為4.0、4.5、5.0和 5.5，反應時間為1 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進行提取的樣品中青蒿素含量為100%進行對照，結果如圖5。酶反應的pH值對青蒿素的提取率基本無影響，在pH值為4.5時，青蒿素提取率達到最大值。

2.6 纖維素酶輔助提取青蒿素工藝條件的優化

在纖維素酶輔助提取青蒿素的過程中，酶反應時間、酶的添加量和酶反應溫度對青蒿素的提取影響較大，而酶反應過程中緩沖液的pH值對青蒿素的提取基本無影響。因此，選取酶反應時間、酶添加量和反應溫度作為主要影響條件，利用試驗設計軟件Design expert 7.5作三因素兩水平正交實驗L4（23），正交實驗水平見表1。

表1 正交實驗水平表

按照軟件設計的正交實驗表中各因素水平，開展實驗，然后對試驗結果進行分析。正交實驗表和結果分析見表2。對實驗結果進行極差分析表明：酶輔助提取反應各條件對提取率的影響試驗中，酶反應時間（A）的最優值為水平1，酶添加量（B）的最優值為水平2，溫度（C）的最優值為水平2，實驗中各因素對輔助提取反應的影響順序為：酶反應時間>酶添加量>溫度。

表2 三因素兩水平正交試驗設計及結果

利用Design expert7.5對實驗結果進行方差分析，方差分析結果見表3。方差分析結果表明：在P<0.05的情況下，試驗中三個因素對提取率的影響均為不顯著。因此，選取實驗中各因素水平的最優值組合，即A1B2C2，作為酶輔助提取的最佳條件。此時，測定樣品中青蒿素的含量達到最大值3.34 mg。因此，纖維素酶輔助提取青蒿素的最佳工藝條件為：酶反應時間為2 h，酶添加量為0.30 g，反應溫度為45℃。在此條件下，通過酶輔助提取得到青蒿素的提取率為3.34 mg/g，與未使用酶輔助提取的方法青蒿素提取率1.13 mg/g相比，優化后酶輔助提取方法中青蒿素提取率提高了1.96倍。

表3 正交試驗方差分析結果

3 討論

黃花蒿為菊科艾屬一年生草本植物，在我國各地均有分布[6]。青蒿素是從黃花蒿干燥地上部分分離提取得到的一種新型化合物，其具有含過氧基團的倍半萜內酯結構，與已知抗瘧藥物化學結構完全不同[7]，被世界衛生組織稱為“唯一有效的瘧疾治療藥物”。由于青蒿素的化學合成尚未顯示出商業可行性，目前商用的青蒿素主要通過植物提取[8]。工業化提取青蒿素中應用范圍最廣的是有機溶劑提取法，但存在提取效率低、提取率不高、溶劑消耗大和安全隱患等問題[3]。

天然產物的有效成分主要存在細胞質中，細胞壁的阻礙影響了提取率。纖維素酶是最常見的破壁酶，它可作用于天然產物纖維素為主的細胞壁，破壞細胞壁的致密結構，增加細胞內活性成分的溶出量，提高提取率[9]。纖維素酶Cellulase T4來源于綠色木霉，本實驗結果表明，纖維素酶能夠有效降解青蒿植物的細胞壁，增加青蒿素的提取率。不同的纖維素酶有不同的最佳反應條件，常見的影響因素有溫度、pH、酶的用量、激活劑和抑制劑等[10]。本文單因素及正交實驗結果表明Cellulase T4水解青蒿植物細胞壁的最佳條件為酶反應時間為2 h，酶添加量為0.30 g，反應溫度為45℃，酶反應pH值4.5。在最優條件下，纖維素酶輔助提取青蒿素較未使用酶輔助的提取方法，提取率提高了1.96倍。本實驗為纖維素酶在青蒿素提取方面的應用提供了理論指導，為酶技術在中藥制藥方面的研究和應用開拓了更為廣闊的空間。

[1]趙兵，王玉春，歐陽藩.青蒿素生物合成機理研究現狀[J].廣西植物，1999，19（2）：154-158.

[2]錢國平.黃花蒿中提取與純化青蒿素的研究[D].杭州：浙江大學，2007.

[3]陳秋實，陳孟蘭，范晶.青蒿素提取研究進展[J].武漢工程學院院報，2007，3（2）：120-125.

[4]何玉娟.黃花蒿植物中青蒿素的提取分離過程研究[D].天津：天津大學，2004.

[5]李春莉，王莎莉，王亞平，等.紫外分光光度法測定青蒿素的含量[J].重慶醫科大學學報，2007，32（4）：413-415.

[6]張小波，郭蘭萍，黃璐琦.我國黃花蒿中青蒿素含量的氣候適宜性等級劃分[J].藥學學報，2011，46（4）：472-478.

[7]張鳳杰，劉祝祥，陳功錫.青蒿藥用成分提取方法及檢測技術研究進展[J].吉首大學學報（自然科學版），2010，31（4）：103-107.

[8]劉春朝，王玉春，歐陽藩，等.青蒿素研究進展[J].化學進展，1999，11（1）：41-48.

[9]張巾英，張明春.應用纖維素酶提取中草藥有效成分的研究進展[J].上海中醫藥雜志，2007，41（1）：79-81.

[10]楊吉霞，蔡俊鵬，祝玲.纖維素酶在中藥成分提取中的應用[J].中藥材，2005，28（1）：64-67.

Study of cellulose assisted extraction of Artemisinin fromArtemisia annua L.

LU Wan-yi

Department of Pharmaceutics,Guangdong Food and Drug Vocational-Technical School,Guangzhou 510663,China

ObjectiveTo study the factors affecting the yield of Artemisinin extracted fromArtemisia annuaL.by using cellulose assisted extraction.MethodsThe content of Artemisinin was determined by using UV spectrophotometric.The effects of reaction time,cellulose dose,reaction temperature,and pH value in the enzymatic reaction were studied,and then orthogonal experiments were carried out to find the optimum operating conditions.ResultsThe optimal conditions of cellulose assisted extraction were found as follows:the reaction time,cellulose dose,reaction temperature and the pH value were 2 h,0.30 g,45℃and 4.5 respectively.ConclusionThe yield of Artemisinin extracted fromArtemisia annuaL.could be improved effectively by using cellulose assisted extraction.

Artemisinin;Cellulose;Extraction

R965.1

A

1674-4721（2013）08（c）-0014-03

2013-02-26 本文編輯：魏玉坡）