氧化苦參堿對體外培養人膀胱癌T24細胞生長的抑制作用及其機制

李 順，劉 泉，魏學斌，黃世明，徐留玉，黃生亮，趙慶利，李 青

(山東大學附屬千佛山醫院，濟南 250014)

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，手術切除雖可取得較好的近期療效，但術后復發率高，3～5年內復發率為50% ～70%，并且30% ～40%復發腫瘤惡性程度增高、浸潤能力增強。膀胱腔內灌注化療是當前預防膀胱癌復發最常用的方法，但其常用的化療藥物對癌細胞殺傷缺乏靶向性，毒副作用大，且存在不同程度的多藥耐藥。因此，尋找高效低毒的灌注藥物對提高膀胱腫瘤療效具有積極意義。近年研究證實，氧化苦參堿(OMT)對體外乳腺癌、胰腺癌等腫瘤細胞有明顯的抑制作用［1，2］。2010年6月～2012年6月，我們觀察了OMT對體外培養膀胱癌T24細胞生長的抑制作用，并初步探討其可能機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌T24細胞，重慶醫科大學實驗診斷教研室惠贈;OMT，寧夏啟元藥業有限公司;絲裂霉素 C(MMC)，Kyowa Hakko Kogyo Co.Ltd.;RMPI 1640培養液，Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，Sigma公司;蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒，碧云天公司;倒置熒光顯微鏡(Motie，China)，酶聯免疫分析儀(Techan，Austria)，凝膠成像系統(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 人膀胱癌T24細胞培養及實驗分組 將T24細胞置于含10%新生小牛血清和雙抗RMPI 1640培養液，37℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱內培養。取對數生長期細胞配成4×104/mL懸液，接種于96孔培養板，設8個復孔，接種3板，繼續培養24 h。以 OMT 0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL 分為 5個實驗組，另設陽性對照組(MMC 20 mg/L)、陰性對照組(不加處理因素)、空白對照組(不加入細胞，其他同實驗組)，溶劑對照組(生理鹽水代替處理因素)。加入不同的處理因素作用24 h后，取出1板加入MTT培養4 h，加入 DMSO 200 μL/孔，振蕩溶解。

1.2.2 膀胱癌T24細胞抑制率檢測 酶標儀用空白對照組調零，檢測波長600 nm處吸光度(OD值)，計算細胞存活率和抑制率。存活率=處理組OD值/陰性對照OD值×100%，抑制率=(1－存活率) ×100%。以 OMT 0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL分為5個實驗組，作用24、48、72 h后分別取一培養板，測定OMT在24、48、72 h對膀胱癌 T24細胞的抑制率，重復3次。

1.2.3 膀胱癌T24細胞的形態學觀察 以 OMT 1.25 mg/mL分為實驗組，設立陰性對照組。取膀胱癌T24細胞制備細胞爬片，常規HE染色及瑞氏染色，分別在低倍和高倍鏡及油鏡下觀察細胞形態變化并攝相。6孔培養板分兩組(OMT 1.25 mg/mL組、陰性對照組)加入不同處理因素，培養72 h收集細胞。分別加入4%戊二醛、1%鋨酸固定，再用乙醇丙酮梯度脫水，618環樹脂包埋后超薄切片。經枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察細胞形態學變化。

1.2.4 流式細胞術(FCM)檢測凋亡細胞 將細胞同步化培養24 h，以分為實驗組、陰性對照組。實驗組加入1.25 mg/mL OMT。再培養72 h收集細胞，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，把細胞緩慢加入到－20℃預冷的70%乙醇固定。將等體積的細胞懸液和PI染液混勻，染色30 min。混合液過300目尼龍網。把樣品放入FCM的樣品室，以激發波長為488 nm測定，并用MODFIT2.0軟件分析細胞周期分布及凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測 Survivin、Caspase-3 的表達培養瓶培養膀胱癌T24細胞，將OMT按0.625、1.25、2.5 mg/mL 濃度梯度加藥于培養瓶中，培養48 h后胰酶消化細胞，取干預后的細胞于EP管。每管加入100 μL細胞裂解液(含PMSF)吹勻。于冰上放置30 min后，4℃ 14000 g離心10 min，取上清并定量，采用BCA法測定蛋白濃度。每管取30 μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸 5 min，經 SDS/PAGE凝膠電泳，然后電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗1∶1000稀釋4℃孵育過夜，二抗1∶5000稀釋室溫孵育2 h后，二氨基聯苯胺顯色并對結果進行灰度掃描分析。重復實驗3次，取平均值。

1.2.6 統計學方法 采用 SPSS10.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較行方差分析。檢驗水準 a=0.05。

2 結果

2.1 OMT對T24細胞增殖的抑制作用 見表1。

2.2 細胞形態學觀察 1.25 mg/mL OMT作用后，光鏡下可見到細胞變為不規則狀，體積縮小，胞質濃縮，胞核凝聚，染色質致密聚集成板塊狀，位于核周膜成新月狀，形成凋亡小體(圖1A)。電子顯微鏡下，癌細胞核質比例縮小，胞質濃縮(圖1B)，核染色質濃縮呈半月形，染色質聚集靠近于核膜周邊，進而細胞膜內陷細胞自行分割為多個具有完整膜性結構，內含各種細胞成分的凋亡小體(見圖1C)。

2.3 T24細胞凋亡檢測結果 FCM分析T24細胞DNA含量，1.25 mg/mL OMT處理組T24細胞與陰性對照組相比，出現G0/G1期阻滯，S期細胞較陰性對照組下降(P ＜0.05)，1.25 mg/mL OMT 處理72 h后，G1期前出現呈特征性的亞二倍峰(凋亡峰)。細胞凋亡率為5.37%。見圖2。

表1 各組不同時間膀胱癌T24細胞增殖抑制情況比較(n=3，%)

圖1 1.25 mg/mL OMT作用后光鏡及電鏡下細胞形態學觀察

圖2 1.25 mg/mL OMT作用72 h后T24細胞周期分布

2.4 各組Survivin、Caspase-3表達比較 見圖3、表2。

圖3 Caspase-3、Survivin蛋白免疫印跡帶灰度

3 討論

保留膀胱的膀胱癌術后患者，2年內超過半數要復發，并且有惡性程度增加趨勢。絲裂霉素C、結核菌素、阿霉素、喜樹堿等相繼應用于膀胱灌注，但復發率仍居高不下，并且具有不同程度的毒副作用。因此，尋找高效低毒的灌注藥物具有廣闊的臨床應用前景。

表2 各組Survivin、Caspase-3表達比較()

表2 各組Survivin、Caspase-3表達比較()

組別 n Caspase-3 Survivin空白對照組8 0.052 ±0.0018 0.632 ±0.00970.625 mg/mL OMT 組 8 0.084 ±0.0019 0.465 ±0.00751.25 mg/mL OMT 組 8 0.165 ±0.0023 0.257 ±0.00262.5 mg/mL OMT 組 8 0.298 ±0.0087 0.142 ±0.0092 P 0.014 0.008

OMT又名苦參素，分子式為C15H24N2O2·H2O，分子量為282，是從中藥苦豆子中提取的一種生物堿。苦豆子，別名苦甘草、苦參草、苦豆根及西豆根，早在《神農本草經》就已載入藥，全株味極苦、性寒，具有清熱解毒、抗菌消炎作用。近年研究發現，OMT有抗腫瘤作用［3］，但國內外尚未見其用于膀胱癌的報道。本研究結果顯示，不同濃度OMT隨著濃度的增長、作用時間的延長對人膀胱癌T24細胞的抑制率逐漸增強，1.25 mg/mL OMT對人膀胱癌T24細胞的抑制率明顯高于陰性對照組、溶劑對照組、0.625 mg/mL OMT 組(P 均 ＜0.05)，≥2.5 mg/mL OMT各組對人膀胱癌T24細胞的抑制率比較差異無統計學意義。1.25 mg/mL OMT作用人膀胱癌T24細胞后，在光鏡、電鏡下均可見到細胞皺縮，胞質濃縮，胞核凝聚，核染色質濃縮呈半月形，染色質聚集靠近核膜周邊，核仁裂解，細胞膜內陷細胞自行分割為多個具有完整膜性結構，內含各種細胞成分的凋亡小體;FCM可見癌細胞株出現典型的調亡峰。提示OMT可以誘導膀胱癌T24細胞的凋亡。

細胞凋亡機制十分復雜，至今尚未完全清楚。近年研究發現，細胞凋亡與凋亡相關蛋白Survivin、Caspase-3表達有關。Survivin基因是新近發現的一種凋亡抑制基因，同時也是迄今發現的作用最強的凋亡抑制因子。膀胱癌組織中Survivin表達量明顯高于正常組織中表達，且其表達與膀胱癌患者的臨床分期和腫瘤分化程度均有一定相關性，在低分化和臨床分期越高的膀胱癌患者中，其表達水平越高［4］。細胞凋亡的發生需激活Caspase。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，具有嚴格的底物特異性，Caspase-3是細胞凋亡過程中必不可少的蛋白酶，是凋亡發生的直接限速酶，表達的高低決定了凋亡的發生和多少［5，6］。Survivin 蛋白通過 Caspase 通路抑制凋亡，可以直接抑制凋亡終末效應器，干擾Caspase 9的活化及Caspase3、Caspase7，從而阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程。競爭性結合p21-cdk4復合物上的cdk4，釋放的p21與Caspase 3形成復合物，抑制Caspase 3的活性，從而間接抑制細胞凋亡。提示Survivin基因可通過多重途徑抑制凋亡，促進腫瘤的形成［7，8］。本研究結果顯示，隨著 OMT濃度升高，Caspase-3蛋白表達顯著增高，Survivin蛋白表達顯著下降，并且呈一定的劑量依賴性。提示OMT能明顯抑制T24膀胱癌細胞增殖，誘導凋亡，其誘導凋亡機制與抑制Survivin蛋白表達，提高Caspase-3在的表達有關，但其確切機制還有待進一步研究。

綜上所述，OMT對體外培養人膀胱癌T24細胞生長有強烈的抑制作用，其機制可能與抑制Survivin表達、上調Caspase-3表達等誘導細胞凋亡有關。

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