枸杞多糖對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

王玉彩，張玉濤，王家君

(1齊河縣人民醫(yī)院，山東 齊河 251100;2山東大學附屬齊魯醫(yī)院)

枸杞多糖(LBP)是枸杞子的主要功效成分。近年研究表明，其具有增加免疫力、抗氧化、抑制細胞凋亡的作用。2007年5月～2008年9月，我們觀察了LBP對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級、雄性、健康SD大鼠60只，鼠齡4個月，體質(zhì)量(257±25)g，由青島市藥檢所動物中心提供，批號:DK120415。LBP由寧夏中藥廠提供純品。超氧化物歧化酶(SOD)放射免疫分析試劑盒由北京華清生化技術研究所提供。Fas、bcl-2兔抗鼠單克隆抗體及SABC免疫組織化學試劑盒均由博士德生物制劑公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 隨機將大鼠分為對照組、模型組、LBP處理組，各組20只。大鼠心肌缺血再灌注模型［1～3］:實驗組、LBP 處理組在 1.55 mol/L烏拉坦5 mg/g靜脈麻醉下，仰位固定，標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖檢測，連接氣管插管待開胸后聯(lián)接人工呼吸機(潮氣量為 2.0 L/100 mg，頻率 50次/min)。在胸骨左緣旁0.5 cm處縱行切開第3～5肋，剪開心包，暴露心臟，結(jié)扎冠狀動脈前降支，同時將一根直徑2 mm塑料管置于結(jié)扎線與冠狀動脈之間，拉緊結(jié)扎線使塑料管壓迫引起冠脈閉塞，造成急性心肌缺血(ST段弓背向上抬高0.2 mV以上)。缺血35 min后，抽去塑料管，進行再灌注120 min。兩組于冠脈結(jié)扎和再灌注前1 min分別由左心腔緩慢注射等量的生理鹽水或1 mg/kg LBP。模型組有4只、LBP處理組2只大鼠死亡。

1.2.2 血清SOD含量檢測 再灌注結(jié)束后，立即從大鼠左心室取血0.5 mL，靜置20 min，3000 r/min離心10 min，取血清，采用SOD放射免疫分析試劑盒直接測定SOD含量。

1.2.3 Fas、bcl-2蛋白的表達檢測 采血后處死動物，取出心臟，生理鹽水反復沖洗后，于多聚甲醛固定液中固定24 h。心肌組織經(jīng)過固定后，常規(guī)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、連續(xù)切片、貼片于涂有多聚賴氨酸的載玻片上備用。采用HE染色觀察各組心肌細胞的損傷情況，采用免疫組織化學法觀察心肌組織中 Fas、bcl-2蛋白的表達。采用 OLYMPUS、BX50獲得顯微圖像。免疫組化染色結(jié)果利用美國Sample PCI圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。每張切片以組織間質(zhì)空白處入射光的值為定標。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，比較采用q檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織學變化 對照組HE染色示心肌細胞結(jié)構清晰，層次清楚，無細胞水腫;模型組HE染色可見細胞水腫，部分細胞結(jié)構不清，密度不均，有細胞簇聚現(xiàn)象;LBP處理組HE染色可見細胞水腫明顯減輕。

2.2 各組Fas、bcl-2免疫組化染色及血清SOD含量比較 見表1、圖1。

表1 Fas、bcl-2免疫組化染色及血清SOD含量測定結(jié)果()

表1 Fas、bcl-2免疫組化染色及血清SOD含量測定結(jié)果()

注:與對照組、模型組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

組別 n Fas bcl-2 SOD(ng/mL)對照組20 0.216 ±3.021 0.389 ±0.012 615.400 ±20.100模型組 16 0.504 ±2.587* 0.201 ±0.010* 904.200 ±32.150*LBP 處理組 18 0.387 ±2.605*#0.376 ±0.007# 757.600 ±27.200*#

圖1 心肌Fas、bcl-2免疫組化染色(×100)

3 討論

心肌缺血組織再灌注后可引發(fā)一系列復雜的反應，使組織細胞損傷繼續(xù)存在，這種血液再灌注使缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象即為缺血再灌注損傷。這一過程涉及許多免疫組織病理生理過程，其中起主導作用的是自由基產(chǎn)物堆積、缺氧和微循環(huán)改變等，最終導致細胞的壞死和凋亡［4］。

在缺血再灌注條件下，氧自由基為主要誘導因子，有多條細胞信號轉(zhuǎn)導通路參與介導心肌細胞的凋亡。SOD是人體中一種內(nèi)生性清除氧自由基的主要酶系，其作用可以特異性地催化氧自由基發(fā)生歧化反應，清除對體內(nèi)有毒性作用的自由基，使其產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡之中。任何增強氧化作用和降低抗氧化作用的因素均可破壞這一平衡，導致一系列的病理生理異常［5］。研究表明，LBP可以增強紅細胞攜氧能力和變形能力，具有調(diào)節(jié)微循環(huán)的流態(tài)和微循環(huán)周圍狀態(tài)的作用，從而降低冠脈阻力，改善心肌缺氧;而且對氧自由基具有清除作用，可抑制脂質(zhì)過氧化反應，抑制細胞凋亡，故具有保護心肌細胞的作用［6］。在本實驗中，模型組血清SOD比對照組明顯升高，說明心肌缺血后生成了大量的自由基，從而對心肌造成損傷;而LBP處理組給予LBP后，血清SOD含量比模型組明顯下降。說明LBP可以抑制可抑制脂質(zhì)過氧化反應，清除自由基。

細胞凋亡是細胞死亡的一種重要形式，即程序性細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡的發(fā)生與許多基因的調(diào)控有關［7］。許多重要的信號分子和信號事件參與了凋亡過程，如bcl家族、Fas/Fas-L等。Fas又稱Apo-1，現(xiàn)名為CD95分子，屬腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體家族成員，是細胞表面的凋亡信號受體［8］。Fas具有誘導細胞凋亡的能力，它可以和Fas配基或Fas抗體相互作用而導致表達Fas的細胞發(fā)生凋亡。在細胞凋亡過程中，bcl-2家族成員也起著至關重要的作用，是細胞凋亡的抑制基因［9］。研究表明，其過度表達能夠抑制許多因素引起的細胞凋亡。在本實驗中，模型組大鼠心肌組織中Fas的表達明顯高于對照組，bcl-2的表達明顯低于對照組。這說明在心肌缺血再灌注過程中，心肌細胞發(fā)生了凋亡;而LBP處理組大鼠的心肌組織中Fas的表達明顯低于模型組，bcl-2的表達明顯高于模型組。說明LBP抑制了心肌細胞的凋亡。

本實驗中HE染色顯示，對照組心肌細胞結(jié)構清晰，層次清楚，無細胞水腫;模型組HE染色可見細胞水腫，部分細胞結(jié)構不清，密度不均，有細胞簇聚現(xiàn)象;LBP處理組HE染色可見細胞水腫明顯減輕。這表明模型組的心肌組織損傷嚴重，而LBP處理組損傷減輕。

總之，LBP通過清除缺血再灌注后血清中的自由基，降低了血清中SOD的含量，促進了bcl-2在心肌細胞的表達，抑制了Fas蛋白的表達，從而抑制了心肌細胞的凋亡，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。

［1］龔躍波，齊國先，李戈，等.丹紅注射液對心肌缺血再灌注大鼠血清一氧化氮合酶、內(nèi)皮素-1的影響［J］.中外醫(yī)療，2007，26(24):32-33.

［2］張新寧，呂琪，張永亮，等.大鼠心肌缺血再灌注模型建立方法的改進［J］.武警醫(yī)學院學報，2008，17(11):941-943.

［3］楊簡，楊俊，丁家望，等.大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型的改良及實驗觀察［J］.中國老年學雜志，2008，28(10):961-963.

［4］徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1834.

［5］姜生禮，楊渭臨，朱丹.老年急性腦梗塞患者血漿LPO和紅細胞SOD測定的臨床意義［J］.陜西醫(yī)學雜志，2000，29(11):686-687.

［6］方建國，丁水平，田庚元.枸杞多糖藥理作用與臨床應用［J］.醫(yī)藥導報，2004，23(7):484-485.

［7］Gerschenson LE，Rostello RJ.Apoptpsis:a different type of cell death［J］.FASEB J，1992，6:450.

［8］Itoh N，Yonehara S，Ishii A，et al.The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis［J］.Cell，1991，66(2):233-243.

［9］Hockenbery D，Nunez G，Milliman C，et al.Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death［J］.Nature，1990，348(6299):334-336.