TNF-α誘導的衰老血管內皮細胞中泛素、細胞周期的變化及意義

趙海梅，譚 翌，楊小端

(南昌大學第三附屬醫院，南昌 330008)

血管內皮細胞連續被覆全身血管內膜，其不僅僅是血液和組織的屏障，還具有其他多種功能，如減少血管通透性、抗血栓作用、調節血管平滑肌、抑制血管壁細胞的游走和增殖等多種功能。內皮細胞受到破壞、損傷，功能降低，引起許多心腦血管疾病發生、發展。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是由單核巨噬細胞產生、釋放的，具有強大功能的炎癥細胞因子，它可調節血管內皮細胞功能、改變其基因表達譜［1］。TNF-α引起的血管內皮細胞損傷破壞在很多心腦血管疾病和血栓疾病的發病中具有重要意義。泛素—蛋白酶體是由泛素以及一系列相關的酶組成。對細胞內多種基本活動非常重要，如降解非必需蛋白質、控制體內蛋白質的降解過程。而當蛋白質裂解作用發生異常時，正常降解過程受到破壞從而產生疾病。2011年3月～2012年3月，我們觀察了衰老血管內皮細胞泛素的表達及細胞周期的改變，并探討了其與心血管疾病發生、發展的關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 原代血管內皮細胞分離取自剖腹產嬰兒術后的新鮮臍帶。M199完全培養基(含20%胎牛血清、4 ng/mL VEGF，Gibco 公司，USA)，胰蛋白酶(Gibco公司，USA)。Trizol試劑(Gibco公司，USA)，PCR引物由北京奧科生物公司合成。流式細胞儀采用美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 血管內皮細胞的培養與分組 取新鮮臍帶約15 cm，剪除兩側受損部分，PBS沖洗靜脈淤血。向臍靜脈內注入0.25%胰蛋白酶約10 mL。放入37℃ PBS液中消化10 min。吸出臍靜脈內消化液，注入離心管中，同時加入新生胎牛血清終止消化。1000 r/min離心5 min，吸除上清液，加入M199完全培養基。取0.1 mL細胞懸液，調整細胞密度至5×105/mL，接種于25 cm2培養瓶中。置于5%CO2、37℃條件下培養。24 h換液，除去死亡細胞及紅細胞。以后每隔2 d換液1次，并補充營養液。當血管內皮細胞在培養瓶中融合80%以上時，0.25%胰蛋白酶3 mL加入內皮細胞中消化分離。倒置顯微鏡下觀察，細胞皺縮、分離時加入含有10%胎牛血清的培養液終止消化。吸管吹打，制成2×105/mL的細胞懸液，按上述培養條件繼續培養傳代。一般約4 d行細胞傳代培養。選取培養瓶中細胞形態良好的第2代臍靜脈血管內皮細胞分為空白對照組、實驗組。實驗組加入20 ng/mL TNF-α 24 h刺激細胞加速衰老，空白對照組不予處理。

1.2.2 泛素的檢測 血管內皮細胞融合80%以上，收集空白對照組及實驗組細胞，Trizol試劑提取細胞總RNA，溶解于20 μL DEPC處理過的三蒸水，備用。在基因庫中查得人泛素 DNA序列，應用primer5.0設計引物。泛素上游引物為5'-TTCGTGAAGACCCTGACCG-3'，下游引物為5'-GGATCTTGGCCTTCACGTTCT-3'。內參照GAPDH上游引物為5'-CTCCATCATGAAGTGTGA CGTT-3'，下游引物為5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCAG-3'，PCR 引物由北京奧科生物公司合成。首次循環94℃變性5 min，94℃變性30 s，52℃ 退火45 s，72℃延伸60 s，共34個循環，最后72℃延伸10 min，2%瓊脂糖凝膠中行凝膠電泳分析。

1.2.3 細胞周期檢測 選取第2代細胞，待細胞融合80%以上，實驗組加入20 ng/mL TNF-α繼續培養24 h，用0.25% 胰蛋白酶消化分離細胞，1000 r/min離心5 min棄上清液，PBS沖洗2次，重懸于500 μL的PBS中，加入5 mL冷乙醇，4℃ 固定過夜。1000 r/min離心5 min，棄乙醇，用5 mL的 PBS+1%胎牛血清洗2次，加入100 μL的10×PI溶液(用 PBS 配制成 500 μL/mL PI，pH 7.0);加入 100 μL RnaseA(用雙蒸水配制成 10 mg/mL，pH 7.5，煮沸15 min)，37℃ 孵育30 min;流式細胞術分析(激發光波長488 nm，發射光波長570 nm);每次獲取15000個細胞，采用BD公司的sinmulSET軟件進行測定及分析。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件，計量資料以表示，比較采用配對t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組泛素mRNA檢測結果比較 泛素 mRNA的表達在空白對照組明顯低于實驗組(P＜0.05)。見圖 1、2。

圖1 兩組泛素、β-actin RT-PCR凝膠電泳結果

圖2 兩組泛素mRNA表達水平比較

2.2 兩組細胞周期的變化 空白對照組細胞生長旺盛，細胞增殖旺盛，處于S期的細胞明顯多于實驗組。實驗組細胞生長減慢，細胞從G1期進入S期的的比例逐漸降低，從G2期進入M期的比例逐漸增加，細胞增殖指數降低。詳見圖3、表1。

3 討論

圖3 對照組及實驗組細胞周期

表1 對照組及實驗組細胞周期比較(%)

血管內皮系統除了作為血液和組織間代謝交換的屏障外，還可產生和分泌多種生物活性物質，對調節血壓和體液平衡具有重要意義［2］。其結構完整和功能正常是多種心血管疾病發生的重要影響因素。衰老及炎癥因子等導致內皮細胞完整性的破壞和內皮細胞功能不全，可引發各種疾病。動脈粥樣硬化時TNF-α合成增多;而人類典型動脈粥樣硬化斑塊中TNF-α陽性率高達90%，且與粥樣硬化的嚴重程度成正比。因此，血管內皮功能障礙被認為是早期動脈粥樣硬化發病機制中的重要事件，同動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、心血管事件的危險因素有密切的關系［3］。

泛素—蛋白酶體是細胞內蛋白質降解主要途徑之一，不但可以清除損傷蛋白，而且還參與細胞凋亡、炎癥、轉錄調控、信號轉導、細胞周期等生物過程［4］。泛素—蛋白酶體途徑是細胞內ATP依賴的蛋白質選擇性降解的主要途徑，是真核細胞內重要的蛋白質質控系統，參與細胞凋亡、MHCⅠ類抗原的遞呈、細胞周期以及細胞內信號轉導等多種生理過程，對維持細胞的穩態具有十分重要的意義［5］。與泛素相關的疾病可分為2種:一種是泛素體系酶突變導致的功能喪失或者是目標底物蛋白識別基序的改變，導致某種蛋白的不穩定;另一種是目標蛋白功能不正常或加速降解。泛素—蛋白酶體途徑是細胞內環境穩定的關鍵調節因素，細胞的許多重要蛋白都在此通路的調控之下。

泛素—蛋白酶體通路對細胞內信號轉導及細胞生長調控是一個很重要的調節因素，并與許多生理及病理過程密切相關。核因子-κB(NF-κB)被認為是在動脈粥樣硬化發生、發展過程中介導炎癥—增殖反應的一種重要的調節因子。在NF-κB的激活中，泛素—蛋白酶體起到重要作用。正常情況下，內皮細胞產生的一氧化氮(NO)能夠抑制NF-κB的轉錄活性，從而拮抗動脈粥樣硬化的啟動，但是各種損傷性刺激增加了氧化應激，使NO的生物利用度減少。抑制泛素—蛋白酶體能夠上調一氧化氮合酶的表達，促進NO的合成［6］。在復雜的分子網絡調節系統中，泛素—蛋白酶體系統在調節細胞周期各個階段及各階段之間的轉換中具有重要作用［7］。不穩定的動脈粥樣硬化斑塊中，氧化低密度脂蛋白的增加或半衰期延長的蛋白質聚集，可導致泛蛋白—蛋白酶體系統(UPS)功能損傷。因為短壽命的促凋亡蛋白p53、bax、p27在細胞內是通過UPS降解的，因此，泛素化通路缺陷時，細胞內上述蛋白質含量增多，可使細胞周期停滯并凋亡。而細胞周期狀態反映了細胞的增殖能力。凋亡細胞增加，血管功能進一步受到損傷，結構遭到破壞。血管內皮細胞調亡可以引起一系列血管結構和功能的改變，最終導致動脈硬化的發生。

本研究結果顯示，實驗組衰老血管內皮細胞泛素表達增高，同時細胞周期停滯，細胞凋亡增加，內皮功能受損。說明泛素—蛋白酶體除了移除受損蛋白質作用外，還參與其他一系列生理病理過程，包括再生、凋亡等，而這些都是動脈粥樣硬化的重要特征［8］。已有研究表明，在動物擴張性心肌病及缺血性心肌病中，泛素化蛋白質的表達明顯升高［9］。而心臟蛋白酶體是一個復雜的、異構的、動態的細胞器。心臟在壓力超負荷、缺血或衰老等時功能退化，均可引起心肌細胞內泛素—蛋白酶體發生變化，導致疾病的發生、發展［10］。因此，我們應進一步研究泛素—蛋白酶系統，改善其功能，減少疾病的發生、發展。

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