醫(yī)院內(nèi)鮑曼不動桿菌感染分布特征及其耐藥機(jī)制

李 娟，郝邯生，王 悅，張利娟

(1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070;2武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院;3天津醫(yī)科大第二醫(yī)院)

鮑曼不動桿菌(Ab)是院內(nèi)感染的重要條件致病菌［1］，近年來臨床Ab分離率逐漸增高，耐藥性不斷加強(qiáng)，并出現(xiàn)多重耐藥、泛耐藥菌株，給臨床治療帶來一定困難［2］。Ab可以具有多種耐藥機(jī)制，如產(chǎn)生藥物鈍化酶或修飾酶、改變藥物作用靶點(diǎn)、外膜蛋白缺失或外排泵高表達(dá)等［3］。整合子［4］作為可移動遺傳元件一直是科研人員關(guān)注的重點(diǎn)，它可以捕獲、整合并表達(dá)外源基因，在細(xì)菌耐藥、多重耐藥演進(jìn)中扮演重要的角色。本研究以分離自天津市某三級醫(yī)院住院患者的Ab為實(shí)驗(yàn)對象，分析其院內(nèi)感染分布特征和耐藥性，并對部分收集自重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)的Ab攜帶Ⅰ類整合子情況進(jìn)行了研究。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選擇2010年7月～2011年6月在天津市某三級醫(yī)院住院患者分離出的Ab 616株(去除重復(fù)菌株)，所有菌株由 MicroScan WalkAway-96SI全自動微生物分析儀進(jìn)行菌種鑒定。隨機(jī)選取其中收集自ICU的57株檢測Ⅰ類整合子。質(zhì)控菌株大腸埃希菌 ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為該院保存。

1.2 方法

1.2.1 Ab抗菌藥物敏感試驗(yàn) 帶有菌液的鑒定藥敏板放入MicroScan WalkAway-96SI全自動微生物分析儀，24 h后儀器會自動報(bào)告菌株及其藥敏情況。頭孢哌酮/舒巴坦和多粘菌素B藥敏實(shí)驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer)。

1.2.2 整合子基因檢測 ①細(xì)菌DNA的提取及基因檢測:采用煮沸法［5］提取細(xì)菌DNA，－20℃保存。②PCR檢測菌株中Ⅰ類整合酶基因、Ⅰ類整合子可變區(qū)，志賀菌N5經(jīng)測序證實(shí)攜帶Ⅰ類整合子，為本實(shí)驗(yàn)的陽性對照。反應(yīng)總體系 25 μL:TaKaRa Premix Taq 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，DNA 模板2 μL，加入無菌去離子水至25 μL。Ⅰ類整合酶基因的引物序列為:上游引物:5'-ACATGTGATGGCGACGCACGA-3'，下游引物:5'-ATTTCGGTCCTGGCTGGCGA-3'，目的片段為569 bp，PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30 個循環(huán)，72℃ 5 min;Ⅰ類整合子可變區(qū)的引物序列為:上游引物:5'-GGCATCCAAGCAGCAAG-3'，下游引物:5'-AAGCAGACTTGACCTGA-3'，目的片段大小可變，PCR反應(yīng)條件:94℃ 5 min，94℃ 45 s，53℃35 s，72 ℃ 2 min，35 個循環(huán)，72 ℃ 5 min。③PCR產(chǎn)物測序:各選2株片段大小一致的可變區(qū)PCR產(chǎn)物送上海英駿生物工程公司測序，結(jié)果在GenBank中用BLAST程序進(jìn)行比對，以確定可變區(qū)的基因盒類型及排列順序。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用WHONET5.4統(tǒng)計(jì)軟件，ICU和非ICU來源的Ab的耐藥率比較采用χ2檢驗(yàn)，整合子陽性、陰性Ab的耐藥率比較采用Fisher確切概率法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源 616株Ab中，來自呼吸道標(biāo)本512株(83.1%)、傷口膿液標(biāo)本 34 株(5.5%)、血液標(biāo)本20株(3.2%)、胸腹水和其他無菌體液標(biāo)本13株(2.1%)、腦脊液標(biāo)本 6 株(1.0%)，其他標(biāo)本 31株(5.0%)。

2.2 科室分布 616株 Ab中，來自 ICU 412株(66.9%)，包括腦系科 ICU 269 株(43.7%)、綜合ICU 143 株(23.2%);非 ICU 204 株(33.1%)，包括腦系科 62 株(10.1%)、呼吸科29 株(4.7%)、燒傷科27株(4.4%)、其他內(nèi)科 54 株(8.8%)和其他外科32 株(5.2%)。

2.3 Ab對各類抗菌藥的耐藥性情況 616株Ab中，均對多粘菌素B不耐藥，其次分別為頭孢哌酮/舒巴坦 85株(13.8%)、左氧氟沙星 282株(45.8%)、氨芐西林/舒巴坦 339 株(55.0%)、復(fù)方新諾明 395株(64.1%)、頭孢他啶 395株(64.1%)、阿米卡星396 株(64.3%)、頭孢曲松 397株(64.4%)、頭孢噻肟 408 株(66.2%)、環(huán)丙沙星413 株(67.0%)、亞胺培南 431 株(70.0%)、妥布霉素 435株(70.6%)、替卡西林/棒酸 436株(70.8%)、慶大霉素443 株(71.9%)、頭孢吡肟 471株(76.5%)、哌拉西林472 株(76.6%)。多重耐藥Ab的檢出率為76.5%(471/616)。

2.4 ICU與非ICU Ab耐藥情況比較 見表1。

表1 ICU與非ICU Ab耐藥情況比較［株(%)］

2.5 基因檢測及序列分析結(jié)果 57株Ab中，Ⅰ類整合酶陽性43株(75.4%)，可變區(qū)陽性39株(陽性率為68.4%)。34株檢測出大小為2310 bp的產(chǎn)物，經(jīng)BLAST比對，所含的耐藥基因盒為 aacA4-catB8-aadA1;5株檢出2470 bp的產(chǎn)物，經(jīng)BLAST比對顯示所含的耐藥基因盒為aacC1-orfA-orfB-aadA1。見圖 1、2。

圖1 Ⅰ類整合酶基因擴(kuò)增結(jié)果

圖2 Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

2.6 ICU來源的AbⅠ類整合子陽性株與陰性株耐藥情況比較 Ab對多粘菌素B均敏感，不納入比較范圍。具體結(jié)果見表2。

表2 Ⅰ類整合子陽性與陰性Ab耐藥率比較［株(%)］

3 討論

Ab廣泛分布于土壤、水、醫(yī)院環(huán)境，并易在住院患者皮膚、口腔、呼吸道、胃腸道及泌尿生殖道等部位定植。Ab被認(rèn)為是一種低毒力病原菌［6，7］，對其毒力因子的研究目前還處于初級階段，它主要引起免疫力低下患者(尤其是重癥監(jiān)護(hù)病房患者)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、敗血癥、繼發(fā)性腦膜炎、外科手術(shù)部位感染等［8，9］。該菌強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力及快速獲得耐藥性的能力使其極易引起醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)流行，給臨床工作者帶來很大的困擾。對Ab進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，及時掌握該菌院內(nèi)感染的分布情況，對指導(dǎo)臨床合理使用抗生素及防控院內(nèi)感染流行意義重大［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，該院Ab耐藥、多重耐藥情況十分嚴(yán)重。檢測的16種抗菌藥物中，Ab對13種藥物的耐藥率均在55.0%以上，其中包括對碳青霉烯類—亞胺培南耐藥。未發(fā)現(xiàn)對多粘菌素B耐藥的菌株，Ab對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為13.8%，提示臨床醫(yī)生仍可以將其作為對抗Ab的一線用藥。在分離的616株Ab中，呼吸道標(biāo)本占83.1%，遠(yuǎn)高于其他類型標(biāo)本，且主要集中在 ICU病房(66.9%)，說明Ab可以引起住院患者(尤其是住ICU患者)呼吸道的細(xì)菌感染或定植，與院內(nèi)獲得性呼吸系統(tǒng)感染及呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎關(guān)系密切。

整合子由 Stokes等［11］首次提出，定位于染色體、質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上，它由5'保守區(qū)(5'CS)、3'保守區(qū)(3'CS)和兩者之間的可變區(qū)組成。5'CS是整合子的基本結(jié)構(gòu)，包括編碼整合酶的基因、整合子重組位點(diǎn)和整合子可變區(qū)啟動子;可變區(qū)含有一個或多個耐藥基因盒;3'CS包括qacEΔ1和sul1，介導(dǎo)季銨鹽類化合物和磺胺類藥物的耐藥。根據(jù)整合酶基因序列的不同，可將整合子分為6類，其中以Ⅰ類整合子最為常見［12］。研究表明，Ⅰ類整合子普遍存在于臨床上分離的革蘭陰性菌中，介導(dǎo)細(xì)菌對氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素等抗菌藥物的耐藥［13，14］。本次監(jiān)測的Ab主要分離自ICU，且ICU來源的Ab耐藥率明顯高于非ICU來源的Ab，故隨機(jī)收集了ICU來源的57株Ab，研究Ⅰ類整合子與其耐藥的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，57株Ab中75.4%攜帶Ⅰ類整合子，68.4%可變區(qū)攜帶耐藥基因盒，且本組Ab可變區(qū)陽性株中87.2%攜帶aacA4-catB8-aadA1形式的耐藥基因盒，推斷該院ICU病房內(nèi)可能存在Ab克隆株的水平傳播。Ⅰ類整合子所攜帶的耐藥基因aacA4編碼對阿米卡星、奈替米星、妥布霉素耐藥，aadA1編碼對壯觀霉素、鏈霉素的耐藥性，aacC1編碼對慶大霉素的耐藥性，catB8編碼對氯霉素耐藥。從分子生物學(xué)角度上來看，該院ICU來源的Ab中Ⅰ類整合子主要介導(dǎo)該菌對氨基糖苷類、氯霉素和磺胺類耐藥，但是通過對耐藥表型的分析比較發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類整合子陽性株對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、哌拉西林、頭孢吡肟等抗菌藥物的耐藥率也高于Ⅰ類整合子陰性株，我們認(rèn)為在Ab中可能存在與Ⅰ類整合子密切相關(guān)的其他耐藥機(jī)制，如Ⅰ類整合子下游連接了可以攜帶耐藥基因的ISCR1元件等等，有待于進(jìn)一步研究。

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