PI-103對人卵巢癌細胞株SKOV3/DDP順鉑化療效果的影響

劉俊，蔡云朗，任慕蘭，吳迪 ，曾婭

(1.東南大學醫學院 江蘇南京 210009;2.東南大學附屬中大醫院婦產科，江蘇 南京 210009)

卵巢癌是目前死亡率最高的婦科惡性腫瘤，化療是卵巢癌的重要治療措施之一。但相當多患者因腫瘤細胞產生藥物耐藥而導致化療失敗，因此，增強對化療藥物的敏感性是提高卵巢癌治療效果的有效途徑之一。腫瘤細胞產生化療耐藥的共同途徑是抑制凋亡，細胞進入凋亡程序的能力直接影響其化療藥物發揮作用的效應。腫瘤細胞抑制進入凋亡程序，進而可以表現出對化療藥物的耐藥性，這也是腫瘤細胞的一種自我保護。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋 白 激 酶 B(serine/threonine kinase，Akt;protein kinase B，PKB)/哺乳動物雷帕霉素靶體蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路具有調節細胞生長、增殖、遷移，促進細胞周期進程以及參與血管形成等多種功能，是最主要的抑制細胞凋亡的信號途徑［1-3］。本研究探討 PI3K/mTOR雙抑制劑 PI-103對人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌順鉑耐藥細胞株(SKOV3/DDP)細胞順鉑化療的影響以及可能機制，進一步闡明該通路與卵巢癌細胞順鉑耐藥的關系，為耐藥卵巢癌的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

SKOV3/DDP(北京市腫瘤醫院藥物研究所)。一抗:Akt兔抗人多克隆抗體、Phospho-Akt(Ser473)抗體(Bioworld公司)，rps6鼠抗人單克隆抗體、Phosphorps6兔抗人單克隆抗體、Bax兔抗人單克隆抗體、Bcl-2兔抗人單克隆抗體(美國Cell signaling biotechnology公司)，β-actin兔抗人單克隆抗體(Sigma公司);二抗:HRP-標記山羊抗鼠IgG、HRP-標記山羊抗兔IgG(北京康為世紀生物科技有限公司);PI-103(Cayman公司);順鉑(DDP，山東齊魯制藥廠);CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所產品;胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI 1640培養基(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SKOV3/DDP細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基，在37℃、5%CO2、相對濕度90%的恒溫培養箱中培養，細胞呈貼壁生長。

1.2.2 PI-103與SKOV3/DDP細胞共同培養 取對數生長期SKOV3/DDP細胞消化制成細胞懸液，調整細胞濃度，以1×105ml－1接種于96孔板，培養24 h后，加入 PI-103 的終濃度為 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1，繼續培養 24、48、72 h，每個樣本設 3個復孔。

1.2.3 PI-103聯合DDP與SKOV3/DDP細胞共同培養 兩種藥物聯合作用時，DDP終濃度為0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 及 100.00 μmol·L－1，PI-103 濃度為 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1，每個樣本至少設3個復孔，繼續孵育72 h。

1.2.4 CCK-8 法測定細胞抑制率 將 1.2.2、1.2.3處理過的96孔板，每孔加20 μl CCK-8溶液，在細胞培養箱內繼續孵育2 h，在酶標儀上測定波長為450 nm的吸光度(OD)值，計算細胞抑制率［抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%］。根據各組DDP濃度和抑制率，計算兩者的回歸系數a、b，代入公式:Y=a+bln X，計算細胞順鉑IC50值。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 實驗分組(1)聯合用藥組:取 PI-103 濃度為 1 μmol·L－1，DDP濃度為 12.5 μg·ml－1(接近于其 DDP IC50值);(2)DDP組:取 DDP 的濃度為 12.5 μg·ml－1;(3)PI-103 組:取 PI-103 的濃度為 1 μmol·l－1;(4)對照組:不加藥物處理。

按以上分組處理SKOV3/DDP細胞后均繼續培養24 h后消化、收集，制成含1×106ml－1的單細胞懸液1 ml，預冷的PBS沖洗3次，加入1 ml預冷的70%乙醇，4 ℃ 固定 24 h，離心，PBS沖洗，用含有10 μg·ml－1PI和 0.1%RNase A 的 PBS液染色，室溫避光30 min后用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot檢測 SKOV3/DDP 細胞 Akt、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、rpS6、磷酸化的核糖體蛋白S6(p-rpS6)、Bcl-2、Bax及β-actin的表達 分別以PI-103、DDP及PI-103、DDP聯合作用于SKOV3/DDP細胞24 h后，每瓶細胞使用400 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解緩沖液抽提細胞總蛋白。40 μg蛋白經聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后轉移至PVDF膜，室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，用含0.05%Tween 20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min;加入相應的堿磷酶標記的二抗(1∶5 000)，室溫1 h，ECL顯影、定影、曝光，結果采用Image J軟件進行灰度分析。以β-actin作為上樣內參，目的蛋白條帶灰度與內參條帶灰度的比值作為各組實驗數據。每個樣本至少重復3次，取平均值。

1.3 統計學處理

4月26日在奔赴阿斯特拉罕途中第三個點即是扎木揚村，在扎木揚渡口渡過伏爾加河，就可以來到建于19世紀的和碩特廟(Хошеутовский хурул)。

2 結 果

2.1 PI-103對SKOV3/DDP細胞生長的影響

見圖1。

圖1 PI-103對卵巢癌SKOV3/DDP細胞生長抑制率的影響Fig 1 The effect of PI-103 on inhibition rate in SKOV3/DDP cell lines

PI-103能夠抑制SKOV3/DDP細胞的增殖，隨著PI-103 濃度的增加(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1)，細胞生長抑制率逐漸增加(P ＜0.001)，而且隨著藥物作用時間(24、48、72 h)的延長，細胞的生長抑制作用也明顯增加(P＜0.001)。

2.2 不同濃度PI-103對SKOV3/DDP細胞順鉑化療的影響

見表1。

表1 PI-103與DDP聯用對SKOV3/DDP細胞生長的抑制率的影響(± s，n=3)Tab 1 The effect of PI-103 combined with DDP on inbibition rate in SKOV3/DDP cell lines± s，n=3)

表1 PI-103與DDP聯用對SKOV3/DDP細胞生長的抑制率的影響(± s，n=3)Tab 1 The effect of PI-103 combined with DDP on inbibition rate in SKOV3/DDP cell lines± s，n=3)

與對照組比較，a P ＜0.05

DDP/μg·mol－1 對照組PI-103 濃度/μmol·L－1 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 F 值 P值0.78 11.53 ±2.11 16.29 ±1.55a 20.46 ±0.06a 25.47 ±1.07a 30.66 ±0.41a 34.33 ±0.41a 136.082 ＜0.001 1.56 14.97 ±2.87 21.87 ±2.84 27.72 ±3.53a 24.36 ±1.03a 42.81 ±1.64a 44.78 ±3.61a 38.763 ＜0.001 3.13 23.49 ±5.19 25.32 ±3.84 36.05 ±2.09a 40.55 ±2.49a 49.12 ±6.32a 51.78 ±4.13a 22.876 ＜0.001 6.25 34.35 ±3.78 37.26 ±1.66 43.31 ±3.15 47.19 ±4.67a 56.94 ±5.58a 61.61 ±2.84a 23.742 ＜0.001 12.5 45.00 ±2.09 44.83 ±1.63 47.78 ±1.32 54.30 ±4.43a 59.39 ±2.26a 62.06 ±1.21a 28.752 ＜0.001 25 60.13 ±1.66 61.71 ±7.23 60.11 ±4.60 64.97 ±2.52 72.40 ±1.72a 75.07 ±1.30a 8.734 0.001 50 69.56 ±4.78 71.32 ±6.70 71.11 ±6.25 72.23 ±6.61 77.77 ±2.45 79.44 ±1.26 1.881 0.171 100 84.33 ±1.28 85.20 ±2.76 84.93 ±1.84 85.69 ±2.71 85.80 ±1.82 86.07 ±2.450.267 0.928

當 DDP 濃度為 0.78 μg·ml－1時，各實驗組SKOV3/DDP細胞抑制率與對照組相比差異均有統計學意義(P ＜0.001)。當 DDP 濃度為 1.56 或 3.13 μg·ml－1，與濃度分別為 0.5、1.0、2.0、4.0 μmol的 PI-103共培養時，SKOV3/DDP細胞抑制率與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.001)。當DDP濃度為6.25或 12.5 μg·ml－1，與濃度分別 1.0、2.0、4.0 μmol·L－1的PI-103共培養時，SKOV3/DDP細胞抑制率與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.001)。當DDP 濃 度 為 25 μg· ml－1，與 濃 度 分 別 為 2.0、4.0 μmol·L－1的 PI-103 共培養時，SKOV3/DDP 細胞抑制率與對照組比較差異均有統計學意義(P=0.001)。可以看出，PI-103聯合DDP給藥比單用順鉑對SKOV3/DDP細胞生長抑制作用更明顯。

以濃度分別為 0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1的PI-103作用于SKOV3/DDP細胞72 h，順鉑IC50值分別為(13.96 ±1.20)、(12.24 ±1.77)、(9.73 ±1.50)、(6.94 ±1.46)、(3.78 ±0.99)及(2.83 ±0.54)μg·ml－1。其中 PI-103 濃度為 0.25μmol·L－1時，順鉑IC50值與對照組比較，差異無統計學意義，其他濃度PI-103作用下順鉑IC50值與對照組比較，其差異有統計學意義(F=35.865，P ＜0.001)。

實驗組與對照組比較，SKOV3/DDP細胞經0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1的 PI-103 作用后對順鉑敏感性分別增加了 12.30%、30.28%、50.30%、72.96%、79.69%。

2.3 單藥及兩藥聯合對細胞凋亡率的影響

見圖2。

圖2 PI-103、DDP單藥及聯合用藥對SKOV3/DDP細胞凋亡的影響(a P ＜0.001)Fig 2 The effect of PI-103 and DDP alone and in combination on the apoptosis of SKOV3/DDP cell lines(a P ＜0.001)

PI-103、DDP及兩藥聯合作用SKOV3/DDP細胞24 h后，FCM檢測其細胞凋亡的變化，PI-103聯合順鉑引起的細胞凋亡改變均明顯高于單獨用藥組，差異有統計學意義(P＜0.001)。

2.4 PI-103、DDP 對 SKOV3/DDP 細胞中 Akt、PAkt、rpS6及P-rpS6表達的影響

見圖3。

圖3 PI-103、DDP單藥及聯合用藥材SKOV3/DDP細胞Akt、p-Akt、rpS6、p-rpS6表達的影響Fig 3 The effect of PI-103 and DDP alone and in combination on the expression of Akt，p-Akt，rpS6，p-rpS6 in SKOV3/DDP cell lines

在SKOV3/DDP細胞中，使用PI-103能夠顯著降低細胞中p-AKT、p-rpS6蛋白的表達(P＜0.001);各組間Akt、rpS6蛋白表達兩兩比較，差異均無統計學意義(P＞0.05);DDP組與對照組比較，各蛋白表達差異無統計學意義(P＞0.05);聯合用藥組與PI-103比較，P-Akt蛋白表達差異有統計學意義(P＜0.001)，其余蛋白表達差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.5 PI-103、DDP對SKOV3/DDP細胞中凋亡相關蛋白Bax與Bcl-2表達的影響

見圖4。

在SKOV3/DDP細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2在對照組細胞中表達量很高，促凋亡蛋白Bax表達量相對較低。以1 μmol·L－1的 PI-103 處理 SKOV3/DDP 細胞24 h，對Bcl-2和 Bax的表達幾乎沒有影響(P＞0.05);以 12.5 μg·ml－1的 DDP 作用于 SKOV3/DDP細胞24 h，Bcl-2表達下調，Bax達上調;而PI-103與DDP聯合作用24 h，Bcl-2表達量進一步下調，Bax表達量顯著增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖4 PI-103、DDP單藥及聯合用藥對SKOV3/DDP細胞Bcl-2、Bax表達的影響Fig 4 The effect of PI-103 and DDP alone and incombination on the expression of bcl-2，bax，in SKOV3/DDP cell lines

3 討 論

目前，鉑類化合物仍是卵巢癌化療的一線藥物，然而鉑類耐藥也是影響卵巢癌化療效果的主要原因。細胞凋亡是順鉑敏感性的決定性因素，PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路是重要的抑制凋亡的途徑。相關文獻表明，該通路與卵巢癌［4］、大腸癌［5］等多種腫瘤的化療耐藥相關，一些研究［4-6］表明，腫瘤細胞中 Akt、mTOR的過表達或磷酸化水平上調與順鉑耐藥有關，而PI3K抑制劑或mTOR抑制劑能增加順鉑敏感性，其機制可能為:活化狀態的Akt直接使BAD磷酸化，從而使抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL活化抑制細胞凋亡;也抑制線粒體中細胞色素C的釋放，維持線粒體的完整性從而抑制細胞死亡;也能磷酸化FOXO轉錄因子調控腫瘤細胞周期進程;還可抑制Bim的磷酸化，影響促凋亡系統的激活，且rp-S6蛋白的磷酸化參與調控促凋亡與抑凋亡系統的mRNA的翻譯如Mcl-1等［2］。Peng等［7］發現，Akt/mTOR通路的激活可以抑制DDP誘導卵巢癌細胞的凋亡作用，引起卵巢癌細胞產生DDP耐藥。將RAD001與DNA損傷誘導劑(如DDP)結合，可以通過調控mTOR通路增強腫瘤細胞對于DDP誘導凋亡的敏感性［8］。但也有研究［9］表明，單用 mTOR抑制劑可能反饋性上調了P-AKT(Ser473)，導致其作用減弱。Mazzoletti等將mTOR抑制劑和PI3K/mTOR雙抑制劑PI-103聯合應用于人卵巢癌細胞與前列腺癌細胞，發現PI-103可以阻止由mTOR抑制劑反饋性激活PI3K/Akt途徑，更大程度地抑制AKT磷酸化，最終明顯減少癌細胞的生長、增殖、侵襲、轉移［10］。也有體外實驗表明，PI-103還能提高紫杉醇、長春新堿、阿霉素等化療藥物抗腫瘤效果［11］。PI-103是一種能同時抑制P13K/mTOR的雙抑制劑，尤其作用于PI3Kα、mTORC1及mTORC2，也作用于70個其他激酶包括Ⅱ、Ⅲ類PI3Ks的多種代表性蛋白激酶，而且PI-103有良好的藥物穩定性、毒副作用小。本研究通過應用PI-103對卵巢癌耐藥株SKOV3/DDP的抗癌活性及其對順鉑化療作用的探究，進一步闡述了PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路與卵巢癌化療耐藥的關系，為改善卵巢癌化療耐藥提供理論依據。

本研究結果表明，PI-103對卵巢癌SKOV3/DDP細胞有明顯生長抑制作用，且具有濃度、時間依賴性，增加DDP對細胞生長的抑制作用，說明PI-103在卵巢癌中有抗癌活性，且能提高順鉑化療敏感性。本研究結果顯示，PI-103能明顯下調PI3K、mTOR的下游重要靶蛋白Akt、rp-S6的磷酸化水平，尤其是PI-103與DDP聯合作用時，能更大程度地抑制磷酸化Akt的表達;而當 DDP 單獨作用時，Akt、p-Akt、rpS6、p-rpS6蛋白的表達幾乎無改變。同時，本研究也觀察到，PI-103單獨作用時凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達幾乎無變化，而DDP單獨作用時能使Bcl-2表達下調，Bax達上調，且聯合PI-103作用時促凋亡蛋白Bax的表達量進一步上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯下調，這說明PI-103可以增加順鉑對凋亡相關蛋白表達的調控，促進SKOV3/DDP細胞的凋亡，最終表現為促進順鉑敏感性。PI-103明顯提高順鉑對SKOV3/DDP細胞生長的抑制作用，且能增強順鉑誘導的細胞凋亡效應，提示PI3K/Akt/mTOR信號通路傳導的阻滯可以提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，PI3K/mTOR雙抑制劑PI-103能夠提高卵巢癌耐順鉑細胞株對順鉑的敏感性，且這種作用主要源于PI-103阻斷了PI3K/Akt/mTOR通路信號傳導，增加DDP對細胞生長的抑制作用，且加強順鉑對Bax與Bcl-2表達的調控及促凋亡作用，最終增強卵巢癌化療效果，為逆轉卵巢癌化療耐藥提供新的契機，因此，PI3K/mTOR雙抑制劑PI-103有望成為逆轉化療耐藥的靶向性藥物。

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