miRNA-21在激素非依賴前列腺癌細胞系PC3中的表達及對其增殖和侵襲性影響

蘇雷，李文思，肖黎，秦盛斐，佟明

(遼寧醫學院附屬第一醫院泌尿外科，遼寧錦州 121001)

前列腺癌已成為影響我國男性尤其是50歲以上男性健康的一個重要因素，向激素非依賴的轉化是前列腺癌進展中最為惡性的事件，它使得疾病幾乎不可治愈［1］。治療雄性激素非依賴性前列腺癌在目前來說仍然是一個臨床難題，這使得改變治療方式非常急迫。自從2005年在高度惡性的膠質母細胞瘤中發現miRNA-21是一種凋亡抑制因子以來，對于它的關注度就一直未減［2］。更引人注目的是，1年以后miRNA-21在6種實體腫瘤中均被發現是一種唯一的上調因子，這6種腫瘤中包括前列腺癌［3］。本實驗通過觀察激素非依賴前列腺癌細胞系PC3在轉染miRNA-21抑制劑后miRNA-21的表達情況，探討miRNA-21對PC3增殖及侵襲性影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人前列腺癌細胞株PC3細胞(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心);RPMI 1640培養基(Gibco公司);活性炭葡聚糖處理的胎牛血清(Biowest公司);Lipo2000轉染試劑(Invitrogen公司);miRNA-21抑制劑(廣州銳博公司);TR-PCR試劑盒(Takara公司);CCK-8反應液(江蘇碧云天公司);Transwell細胞培養(Chemicon公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 人前列腺癌細胞株PC3置RPMI 1640完全培養基中(不含抗生素)，37℃、5%CO2飽和濕度下培養箱內培養，隔日換液1次，細胞平鋪培養瓶底超過85%時進行傳代。轉染前1 d鋪96孔板，次日將miRNA-21抑制劑按轉染試劑盒操作說明進行轉染。

1.2.2 RT-PCR檢測miRNA-21的表達 將轉染后的人前列腺癌細胞株PC-3(轉染組)接種于96孔板完全培養基中，并且鋪滿約90%。設置未加miRNA-21抑制劑轉染組為空白對照組，孵育48 h后，Trizol法提取細胞總RNA后用miRNA提取試劑盒提取miRNA，反轉錄合成cDNA，配置PCR反應液擴增后，取10～20 μl點樣在濃度為 2% 的瓊脂糖凝膠上(含 0.5 μg·ml－1溴化乙錠)，0.5 μl TAE 作為電泳緩沖液，以160 V電壓進行電泳，30 min停止電泳。紫外透射儀觀察電泳結果并攝取圖像，應用GSG2002核酸/蛋白質凝膠圖像分析管理系統進行灰度值測定，以每一樣品與其內參β-actin的比值代表該樣品miRNA-21的相對含量。

1.2.3 CCK-8檢測轉染后細胞增殖 將轉染后的人前列腺癌細胞株PC-3接種于96孔板完全培養基中，并且鋪滿約90%，轉染組與空白對照組分別孵育24、48、72 h。已接種好細胞的孔板每孔中加10 μl CCK-8檢測液和100 μl完全培養液，孵育2 h后放入酶標儀中檢測，以450 nm吸光度值進行讀數并記錄數值。

1.2.4 Transwell小室結合CCK-8檢測細胞侵襲力取24孔0.8 μm的Tanswell細胞培養板(上室內已鋪好基質膠)，按Chemicon公司的說明要求，在上室加入300 μl預溫的無血清培養基，室溫下靜置20 min，使基質膠水化，再吸除培養基，將轉染組與空白對照組的PC3細胞經胰酶消化后，以 2×103ml－1接種于Transwell細胞培養板上室，待細胞貼壁后，更換上室內培養基為無血清培養基。下室用胎牛血清培養基，培養36 h，除去上室內細胞，用CCK-8法間接檢測小室培養板下室的細胞吸光度即代表穿過基質膠及聚碳酸酯膜細胞的數量，對比穿過細胞數量即代表侵襲力變化。

1.3 統計學處理

所有資料均采用SPSS18.0統計軟件進行數據分析。在符合正態性和方差齊性的前提下，以±s進行統計學描述;統計推斷則采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miRNA-21的相對含量

RT PCR檢測顯示，miRNA-21相對表達量空白對照組為0.50 ±0.02，轉染組為 0.34 ±0.01，兩組間差異有統計學意義(P＜0.05)，表示經過轉染能成功抑制miRNA-21在PC3中的表達(圖1)。

圖1 對照組與轉染組miRNA-21的相對表達量PC3.The control group;PC3-IN.Transfection groupFig 1 Relative expression of micrornas-21 in control group and transfection group

2.2 CCK-8檢測細胞增殖

見表1。

72 h增殖分析結果顯示，轉染組與空白對照組細胞增殖情況差異有統計學意義(24 h:t=2.792，P＜0.05;48 h:t=16.067，P ＜0.01;72 h:t=19.902，P ＜0.01)，表明抑制miRNA-21的表達后PC3細胞的增殖能力明顯降低。

表1 CCK-8檢測PC3細胞吸光值(A)(x±s)Tab 1 CCK 8 testing PC3 cells absorb light values(A)(x±s)

2.3 Transwell小室結合CCK-8法檢測細胞侵襲力

CCK-8法檢測吸光度結果表明，轉染組吸光度值為0.28 ±0.04，空白對照組吸光度值為 0.63 ±0.06，兩組差異具有統計學意義(P＜0.01)，表明抑制miRNA-21的表達后PC3細胞的侵襲力降低。

3 討 論

miRNA是真核生物中一種約22～24個核苷酸大小、參與轉錄后基因調控的非編碼單鏈小分子RNA。它可特異性的識別靶mRNA的3'-非翻譯區(3'-UTR)并與之結合，引起靶mRNA的降解或翻譯抑制，進而對基因進行轉錄后的表達調控，調節許多重要的細胞生物學行為［4］。在過去的短短幾年中，在大樣本癌癥人群中對miRNA已經進行了廣泛的研究，普遍采用的方法是基因雜交，或基于PCR的技術手段，包括寡核苷酸微矩陣研究，基于免疫磁珠的流式細胞儀檢測以及qRT-PCR等。在眾多的癌癥中，miRNA-21表現出過度的表達(如前列腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌等)。盡管對于miRNA-21是不是原癌基因或者miRNA-21在癌癥中是否起到關鍵性的作用還存在較大的爭議，但是miRNA-21已經是眾多miRNA中最受關注和研究的最為深入的miRNA之一。Lu等［5］在對各種實體腫瘤和其對應的正常組織的miRNA大規模的篩查中發現，miRNA-21在PC-3中的表達水平較其他腫瘤細胞，如 HEL、TF-1、293、MCF-7 和 SKMEL-5 等顯著增高。這項研究提示，我們miRNA的資料具有高度的信息價值，并且關系到腫瘤發生中的不同譜系和不同階段。另外，這一結果與 Chan 等［6］和 O'donnrl等［7］發表的文獻結果相同。高水平miRNA-21的單一表達能有效地對付去勢的拮抗作用。更重要的是，RT-PCR分析顯示，miRNA-21在PCa中的表達遠遠高于其鄰近正常組織。這些結果都說明miRNA-21能促進PCa的病理發生過程并且可作為癌癥侵襲的標志［8］。

本實驗通過轉染miRNA-21抑制劑，直接抑制了人前列腺癌細胞株PC3中miRNA-21的表達。在成功抑制miRNA-21的表達后通過CCK-8法測得轉染組細胞增殖能力減弱，證明了miRNA-21的低表達可降低細胞增殖能力。但細胞的增殖能力并不能反映其侵襲能力，而Transwell小室的構建(使得腫瘤細胞要向下室內遷移，則必須突破的基質膠方能進入下室)能較好地反映其侵襲性，且采用CCK-8法間接測量比傳統光鏡下多視野直接計數法更為準確。實驗中轉染組的侵襲性較空白對照組的侵襲性明顯減弱(P＜0.01)，說明抑制miRNA-21的表達后，PC3細胞侵襲能力減弱。因此，抑制miRNA-21在非激素依賴性前列腺癌細胞PC3中的高表達能減弱其增殖及侵襲能力，為進一步進行體內腫瘤細胞侵襲能力的研究奠定了基礎，并可能通過調節miRNA-21的表達來抑制腫瘤的增殖及侵襲能力。

我們考慮miRNA-21在體內可能通過誘導G1期的細胞進入細胞周期，促使雄性激素依賴的細胞生長。通過反義鎖定寡核苷酸或者是拮抗劑減少非雄性激素依賴的PC3的集落形成和腫瘤的發生。miRNA-21在前列腺癌細胞的過度表達，降低了雙氫睪酮的含量，引起PSA的上調，增強了非雄性激素依賴性的增長。提示miRNA-21有可能控制了關鍵因子在非依賴性前列腺癌細胞PC3的表達，這些關鍵因子和維持雄性激素耐受性疾病的發生有關。這個發現為我們進一步研究雄性激素非依賴性前列腺癌提供了理論價值。

［1］GANDELLINI P，FOLINI M，ZAFFARONI N，et al.Towards the definition of prostate cancer-related microRNAs:where are we now［J］.Trends Mol Med，2009，15(9):381-390.

［2］CHAN J A，KRICHEVSKY A M，KOSIK K S.MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells［J］.Cancer Res，2011，65(14):6029-6033.

［3］VOLINIA S，CALIN G A，LIU C G，et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.ProcNatl Acad Sci USA，2010，103(7):2257-2261.

［4］CHEN C Z，LI L，LODISH H F，et al.MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differenti-ation［J］.Science，2010，303(5654):83-86.

［5］LU J，GETZ G，MISKA EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435:834-838.

［6］CHAN J A，KRICHEVSKY A M，KOSIK K S.MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells［J］.Cancer Res，2008，65:6029-6033.

［7］O'DONNELL K A，WENTZEL E A，ZELLER K I，et al.c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression［J］.Nature，2007，435:839-843.

［8］RIBAS J，NI X，HAFFNER M，et al.miRNA-21:an androgen receptor regulated microRNA that promotes hormone-dependent and hormone-independent prostate cancer growth［J］.Cancer Res，2009，69(18):7165-7169.