BTG1在HK-2和786-O細胞株中的表達及其對細胞周期和細胞凋亡的影響

劉春輝，許斌，2，張磊，盧凱，陳恕求，2，陳明，2

(1.東南大學醫(yī)學院，江蘇南京 210009;2.東南大學附屬中大醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210009)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的90%，是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其中約85%為腎透明細胞癌［1］。B細胞易位基因 1(B-cell translocation gene 1，BTG1)屬于BTG/TOB家族。研究表明，該家族的所有成員都具有抗增殖活性［2］。但BTG1在腎細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明確。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，BTG1在腎透明細胞癌組織中低表達［3］。本研究進一步通過 Western blotting方法檢測BTG1蛋白在人腎小管上皮細胞株(HK-2)、腎透明細胞癌細胞株(786-O)中的表達，并構(gòu)建BTG1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-O，合成BTG1干擾RNA轉(zhuǎn)染HK-2，通過流式細胞儀(FACS)觀察BTG1對HK-2、786-O細胞株周期和凋亡的影響，進一步明確BTG1在腎細胞癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 HK-2購自上海生命科學研究院細胞庫，786-O購自中國科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人 BTG1抗體購自 Abcam(Hong Kong)公司，兔抗人 GAPDH抗體購自 Santa Cruz公司，辣根過氧化酶標記的二抗(山羊抗鼠、山羊抗兔)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購自Millipore公司，細胞周期試劑盒購自聯(lián)科生物公司，AnnexinⅤ-FITC、PI凋亡試劑盒購自UBio公司，Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，pcineo質(zhì)粒由南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生實驗室惠贈，Top 10感受態(tài)細胞為本實驗室自行保存，ECORⅠ、Mlu 1內(nèi)切酶，T4連接酶購自Takara公司，ECL發(fā)光試劑購自碧云天公司，高純度質(zhì)粒中量小提試劑盒購自天根生化科技有限公司，胎牛血清購自HyClone公司，RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 以含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%的胰蛋白酶消化細胞，每周傳代2～3次。

1.2.2 BTG1表達質(zhì)粒的構(gòu)建 實驗方法參見文獻［3］。

1.2.3 BTG1抑制劑(BTG1-siRNA)合成 實驗方法參見文獻［3］。

1.2.4 細胞瞬時轉(zhuǎn)染 實驗方法參見文獻［3］。質(zhì)粒用量為 3 μg，RNA 為 200 pmol。

1.2.5 Western blotting檢測BTG1蛋白表達 實驗方法參見文獻［3］，以GAPHD作為內(nèi)參。

1.2.6 FACS檢測細胞周期 細胞轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞，以75%乙醇固定，－20℃保存24 h后，以1 000 r·min－1離心 5 min，棄上清，加入 3 ml PBS，彈松細胞，靜置15 min，離心后棄上清。加入1 ml細胞周期固定液，震蕩5 s，靜置30 min后送檢。

1.2.7 FACS檢測細胞凋亡 細胞轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞。PBS輕洗細胞2次，加入500 μl×binding buffer重懸細胞。細胞懸液中加入5 μl AnnexinⅤ-FITC試劑，混勻后4℃避光孵育15 min，加入10 μl PI，輕輕混勻，4℃避光孵育5 min，1 h內(nèi)送檢。

1.3 統(tǒng)計學處理

每組實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用IPSS13.0軟件處理。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blotting檢測BTG1蛋白的表達

見圖 1、2。

圖1 BTG1蛋白在HK-2及786-O中的表達Fig 1 The expression of BTG1 protein in HK-2 and 786-O

圖1顯示，BTG1蛋白在HK-2細胞中的表達高于在786-O細胞中的表達。

圖2 細胞轉(zhuǎn)染后BTG1蛋白的表達Fig 2 The expression of BTG1 protein after transfection

圖2顯示，與空白對照相比，HK-2細胞轉(zhuǎn)染BTG1抑制劑后，BTG1蛋白表達量下降。786-O細胞轉(zhuǎn)染BTG1表達質(zhì)粒后，BTG1蛋白表達量增高。

2.2 BTG1蛋白高表達對786-O細胞凋亡的影響

見表1、圖3。

表1 786-O轉(zhuǎn)染BTG1表達質(zhì)粒及空白對照后細胞凋亡比率 %Tab 1 The ratio of cell apoptosis after 786-O transfected of BTG1 expression plasmid and negative control%

圖3 786-O轉(zhuǎn)染BTG1表達質(zhì)粒后細胞凋亡流式圖Fig 3 The chart of cell apoptosis after 786-O transfected of BTG1expression plasmid and negative control examined by FACS

表1、圖3顯示，與空白對照比較，786-O細胞轉(zhuǎn)染BTG1表達質(zhì)粒后，細胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均增加(均P＜0.01)。

2.3 BTG1蛋白低表達對HK-2細胞凋亡的影響

見表2、圖 4。

表2 HK-2轉(zhuǎn)染BTG1抑制劑及空白對照后細胞凋亡比率 %Tab 2 The ratio of cell apoptosis after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control %

圖4 HK-2轉(zhuǎn)染BTG1抑制劑后細胞凋亡流式圖Fig 4 The chart of cell apoptosis after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control examined by FACS

表2、圖4顯示，與空白對照相比，HK-2轉(zhuǎn)染BTG1抑制劑后，細胞早期凋亡率下降(P＜0.01)，晚期凋亡率及總凋亡率減少，但差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 BTG1對786-O細胞周期的影響

見圖 5、6。

圖5 786-O轉(zhuǎn)染BTG1表達質(zhì)粒后細胞周期柱形圖Fig 5 The column chart of cell cycle after 786-O transfected BTG1 expression plasmid and negative control

圖6 786-O轉(zhuǎn)染BTG1表達質(zhì)粒后細胞周期流式圖Fig 6 The chart of cell cycle after 786-O transfected BTG1 expression plasmid and negative control

圖5、6顯示，與空白對照相比，786-O細胞轉(zhuǎn)染BTG1表達質(zhì)粒后使G0/G1期細胞增多(分別為41.18% ± 1.03% 與 30.78% ± 0.93%，P ＜ 0.01)，S期細胞減少(分別為43.07% ±2.35%與56.43% ±2.14%，P ＜0.05)。G2/M 期細胞在兩組間差異無統(tǒng)計學意義。

2.5 BTG1對HK-2細胞周期的影響

見圖 7、8。

圖7 HK-2轉(zhuǎn)染BTG1抑制劑后細胞周期柱形圖Fig 7 The column chart of cell cycle after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control

圖7、8顯示，HK-2細胞中轉(zhuǎn)染BTG1抑制劑后，G0/G1期細胞減少(分別為 34.64% ±0.88%與51.17% ±1.84%，P ＜0.01)，S 期細胞增多(分別為58.70% ±1.17%與 32.33% ±0.23%，P ＜0.01)，G2/M期細胞增多(分別為6.33% ±1.44%與16.49% ±2.07%，P ＜0.01)。

3 討 論

腎癌是世界上十大常見腫瘤之一，2012年美國腎癌新發(fā)病人64 770人，死亡患者13 570人，較2011年均有所增加［4］。雖然技術(shù)的進步，尤其是影像技術(shù)的進步，使得腎癌能夠更早的發(fā)現(xiàn)，但是仍然有20% ～30%的患者被發(fā)現(xiàn)時腫瘤已經(jīng)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移［5］，并且約有20%接受手術(shù)的患者在手術(shù)后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［6］。所以，明確腎癌的發(fā)病原因，為尋找有力的治療方案提供理論支持一直是國內(nèi)外研究的熱點。本實驗以明確BTG1基因?qū)K-2及786-O細胞周期及細胞凋亡的影響為主要研究目的。

圖8 HK-2轉(zhuǎn)染BTG1抑制劑后細胞周期流式圖Fig 8 The chart of cell cycle after HK-2 transfected of BTG1 inhibitor and negative control examined by FACS

BTG1屬于BTG/TOB家族，最早發(fā)現(xiàn)于淋巴細胞白血病。BTG1基因位于12q22染色體，mRNA全長1.8 kb，在G0/G1期細胞中高表達，在S/M期細胞中低表達。BTG/TOB家族由6編碼蛋白的分子質(zhì)量為19 kD，在 G0/G1期細種抗增殖蛋白組成(BTG1、BTG2/PC3/Tis21、 BTG3/Ana、 BTG4/PC3B、 TOB/TOB1、TOB2)，其主要結(jié)構(gòu)特征是在N'端有104～106個高度同源性的氨基酸，這個同源區(qū)域包括兩個保守的同源區(qū)A盒和B盒［7］。A盒主要有抗增殖作用，B盒主要有與靶分子結(jié)合的功能［8］。

研究發(fā)現(xiàn)，BTG1能夠抑制NIH3T3細胞［9］和骨細胞［10］的增殖，促進乳腺癌［11］及 MCF-7 細胞［12］的凋亡。在本研究中，我們觀察到高表達BTG1能夠促進786-O細胞凋亡，低表達BTG1能夠抑制HK-2細胞凋亡。但是BTG1的具體作用途徑尚不明了。已有研究表明，BTG1的促凋亡作用可能與P53介導的NF-κB的調(diào)控有關(guān)。也有研究表明可能是BTG1參與了DNA的甲基化，進而誘導了細胞的凋亡。Nahta等［13］則證明，BTG1通過Bcl-2的負調(diào)控誘導乳腺癌細胞的凋亡。BTG1還通過與JAK/STAT1中的LPS、IFN-γ作用促進腫瘤細胞的凋亡［14］。

腫瘤的增長與細胞的增殖密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，BTG2和TOB1的抗增殖作用是通過其與Caf1a/Caf1b脫腺苷酶的相互作用實現(xiàn)的［12］。而細胞的增殖也與細胞分裂速度、凋亡等有著密切的關(guān)系。細胞分裂速度減慢將明顯降低腫瘤的生長速度。我們的研究表明，BTG1能夠?qū)⒓毎铚贕0/G1期，阻止細胞的分裂。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn) BTG1能夠調(diào)節(jié)786-O及HK-2細胞的凋亡及細胞周期。可能通過這兩方面，影響細胞增殖等生物行為。但其具體機制仍需要我們進一步研究。同時，BTG1的具體作用途徑尚不明了，需要我們進一步明確。

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