腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型分離株的VP1基因特征分析

張建華，江炳福，程險峰，游賢惠，孟繼鴻

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009;2.紹興文理學院 醫學院，浙江 紹興 312000;3.南京市兒童醫院，江蘇 南京 210008)

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是一種以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎為主要特征的小兒急性傳染病。多種腸道病毒可引起HFMD，其中以腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackie A16，CA16)最多見［1］。通常情況下，EV71感染引起的神經系統并發癥較CA16等多見，故備受人們的關注［2］。近年來，在東南亞地區HFMD流行有上升趨勢［3-6］。在我國，HFMD自1981年在上海出現以來，相繼在北京、天津、福建等地均有報道［7］。2008年3月，我國安徽省阜陽市發生了較大規模的HFMD疫情，引起了社會的廣泛關注［8］。目前，HFMD尚無疫苗和特異性抗病毒藥物，故加強EV71和CA16的分子流行病學監測，及時了解掌握病毒變異狀況和進化動態，對于控制HFMD流行、疫苗候選株的挑選等具有十分重要的意義。

本研究小組2009至2010年從南京市和馬鞍山市HFMD患兒臨床標本中分離出多株EV71和CA16病毒，通過擴增和測定VP1基因序列，并與標準毒株及國內外常見的參考毒株進行比較分析，研究其遺傳學背景和種系進化關系，為EV71-CA16聯合疫苗研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 標本采集與病毒分離

臨床診斷為手足口病的患兒咽拭子和(或)肛拭子標本由南京市兒童醫院和馬鞍山市疾病預防與控制中心提供，－80℃保存備用。按照《手足口病預防控制指南(2009版)》關于樣品采集及檢測技術方案進行預處理，接種單層非洲綠猴腎細胞(Vero)，置于36℃、體積分數5%的CO2培養箱連續培養7 d，盲傳2代，若出現人腸道病毒特征性的細胞病變效應(CPE)，則于－80℃保存備用。

1.2 病毒RNA提取及RT-PCR鑒定

取病毒分離物上清140 μl，用QIAamp病毒RNA抽提試劑盒(QIAGEN)提取病毒RNA。采用一步法RT-PCR試劑盒(QIAGEN)進行擴增，引物分別為腸道病毒通用引物、EV71和CA16特異性引物［9］。一步法RT-PCR 的反應體系為 20 μl，包括:RNA 5 μl，5 × RTPCR 緩沖液 4 μl，dNTP Mix(10 mmol·L－1)0.8 μl，Enzyme Mix 0.8 μl，上下游引物(10 pmol·μl－1)各0.5 μl，用水(RNase-free)補足至 20 μl。一步法 RTPCR的擴增條件為:42℃逆轉錄45 min;95℃變性3 min;95 ℃變性20 s，45 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，32個循環;72℃末次延伸10 min。實驗設陰性對照，PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.3 全長VP1基因擴增

以病毒RNA為模板逆轉錄合成cDNA，采用高保真PCR試劑盒(Roche)擴增VP1全長基因，EV71-VP1基因擴增采用引物EV71-VP1-F/R，CA16-VP1基因擴增采用引物CA16-VP1-F/R，引物序列見表1。PCR的反應體系為25 μl，擴增條件為:94℃ 預變性3 min;94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35個循環;72℃末次延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收DNA后送Invitrogen公司測序。

表1 RT-PCR擴增用引物序列

1.4 基因序列分析和構建系統進化樹

利用生物信息學軟件DNAStar Lasergene 7.0對正反向核苷酸序列進行整理和拼接。從GenBank下載EV71和CA16原型株以及各基因型參考毒株VP1基因序列，利用MEGA 5.0進行多序列比對以及構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 EV71和CA16病毒株的分離與RT-PCR鑒定

從HFMD患者臨床標本中共分離到13株病毒。用腸道病毒通用引物行RT-PCR鑒定，發現13株病毒均屬于腸道病毒。在此基礎上，同時用EV71和CA16特異性引物行RT-PCR，結果顯示，13株病毒中9株為EV71，4 株為 CA16。

2.2 EV71和CA16分離株 VP1基因擴增和序列測定

用EV71和CA16的VP1基因區外側引物進行PCR擴增，PCR產物大小分別為1 015 bp(EV71-VP1)和1 370 bp(CA16-VP1)，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收純化，送Invitrogen公司測序。

2.3 EV71結構蛋白VP1基因的序列同源性和系統進化分析

將9株新分離的EV71毒株VP1基因進行同源性分析顯示，其核苷酸和氨基酸同源性分別為96.5%～99.8%和99%～100%。與EV71各基因型毒株VP1序列進行核苷酸與氨基酸同源性比對及系統進化分析，結果見表2和圖1。同源性分析結果顯示，9株新分離的EV71毒株與A、B基因型的毒株差異較大，但與C基因型比較接近，尤其是C4a基因亞型，其核苷酸同源性高達94.4%～100%，氨基酸同源性高達98.7%～100%。系統進化樹分析顯示，9株EV71毒株與C4a基因亞型處于同一分支。以上結果說明這9株EV71分離株為C4a基因亞型。

2.4 CA16結構蛋白VP1基因的序列同源性和系統進化分析

4株新分離的CA16毒株VP1基因進行同源性分析顯示，其核苷酸和氨基酸同源性分別為96.2%～98.5%和99.3%～100%。與29株不同基因型的CA16參考毒株比對及系統進化分析，結果見表3和圖2。同源性比對結果顯示，4株CA16的VP1核苷酸序列與A基因型差異最大，B2基因亞型次之，與B1基因亞型最接近，尤其是B1b基因亞型。氨基酸序列除了A基因型外，與其他基因亞型差異不大。系統進化分析顯示，4株CA16毒株與B1b基因亞型處于同一分支。這些結果說明，4株CA16毒株均屬于B1b基因亞型。

表2 9株EV71與不同基因型(亞型)代表株VP1核苷酸與氨基酸同源性比較

表3 4株CA16與不同基因型(亞型)代表株VP1核苷酸與氨基酸同源性比較

3 討 論

HFMD是一種嬰幼兒常見的發熱和出疹性疾病。自2008年以來，該病在中國大陸一直呈高流行態勢。HFMD可由多種腸道病毒引起，其中以EV71和CA16最為多見。早期發現的HFMD主要由CA16引起，EV71于1969年在美國首次分離確認［10］，20世紀70年代以后，EV71和CA16感染交替出現。近年來，HFMD在東南亞地區疫情嚴重，流行過程中大多同時檢測到EV71和CA16兩種病原體。2008年安徽阜陽暴發的HFMD中，EV71是最主要的病原體，也有一定數量的CA16感染［11］。同年寧夏地區暴發的HFMD則以CA16感染為主［12］。最近嵇紅等人報道了2008至2010年江蘇省HFMD流行病學和病原學研究結果，認為輕癥病例以EV71和CA16共同主導流行，而重癥病例和死亡病例則以EV71感染為主［13］。

圖1 基于EV71全長VP1基因核苷酸序列構建的系統進化樹 “▲”為本研究新分離EV71毒株

圖2 基于CA16全長VP1基因核苷酸序列構建的系統進化樹 “▲”為本研究新分離CA16毒株

EV71和CA16均屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬A組，基因組為單股正鏈RNA，約含7 400個核苷酸，僅含有1個開放讀碼框，包括P1、P2和P3基因區，其中P1基因編碼結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。通常認為，VP1蛋白直接決定病毒的抗原性，具有與病毒血清型基本對應的遺傳多樣性。我們利用大腸桿菌表達了EV71全長VP1蛋白，利用間接ELISA和免疫印跡法檢測顯示，VP1蛋白具有良好的抗原性，可與EV71感染患者血清以及動物免疫血清良好反應［14］。故VP1區的核苷酸序列可作為腸道病毒血清型鑒定和基因分型的依據。

本次研究中共分離到9株EV71和4株CA16毒株，在測定這些毒株VP1全長基因序列的基礎上進行同源性比對和系統進化樹分析。這些分離毒株的VP1基因序列高度一致，9株EV71的核苷酸同源性為96.5%～99.8%，4株CA16的核苷酸同源性為96.2%～98.5%。這些數據表明，這些毒株均分別來自EV71和CA16的一個基因亞型。與EV71各基因型代表株進行比較顯示，9株EV71與C4a基因亞型最接近，其核苷酸和氨基酸序列同源性分別為94.4%～100%和98.7%～100%。董曉楠等分析了1970至2004年全球532株EV71分離株的VP1核苷酸序列，認為同源性高于85%的毒株為同一基因型，高于91%為同一基因亞型［15］。目前，根據 VP1核苷酸序列的差異，可將EV71分為A、B和C基因型;B和C基因型又可進一步分為B1～B5和C1～C5基因亞型。目前，我國大陸地區流行的EV71絕大多數屬于C4亞型，從系統進化樹可以看出，C4亞型又可以分成C4a和C4b兩個分支，2004年以前多為C4b亞型，而近年來中國大陸流行的EV71毒株幾乎都是C4a亞型［16］。從圖1可以看出，我們分離獲得的9株 EV71也屬于C4a基因亞型。

與EV71相比，CA16相對保守，VP1區基因序列變異也較小。目前，CA16的基因分型存在兩種觀點:一種觀點認為可將CA16分為A、B、C 3個基因型，C型可進一步分為C1、C2和C3基因亞型，B和C基因型之間的差異在5.8%～11%之間，C1～C3基因亞型之間的差異在0～4.6%［17-19］;另一種觀點認為不同基因型之間的差異應大于15%，這樣可將CA16分為A、B兩個基因型，其中B基因型又可分為B1和B2兩個分支［20］。若參照EV71基因型劃分標準，即不同基因型VP1的核苷酸差異應該大于15%，同一基因型不同亞型之間的差異應該在6%～11%之間，則選擇上述第2種觀點的分型標準較為合適。如圖2所示，CA16的原型株G-10和2008年安徽阜陽株FY-18屬于A基因型，其余為B基因型。B基因型又有兩個分支:1支為早期CA16分離株，主要在1981至2000年間流行，劃分為B2基因亞型;另1支以2000年后CA16分離株為主，劃分為B1基因亞型。B1亞型又可明顯地分為兩大簇，分屬于B1a和B1b兩條進化分支。近年來國內有關CA16分子進化方面研究發現，我國目前流行的CA16毒株主要是B1亞型，而且B1a和B1b兩個進化分支在同一流行地區出現共循環現象［21-23］。我們分離到的4株CA16毒株處在B1b進化分支上，故屬于B1b基因亞型，與河南分離株HN1539、深圳分離株SZ/HK08-7、廈門分離株XM-3560具有最高的核苷酸同源性。目前，針對CA16的分子進化研究相對較少，尚無國際公認的基因分型標準，但隨著CA16分離株的增多，GenBank收錄的相關基因序列逐漸豐富，CA16的基因分型標準將會得到進一步的完善和確立。

加強對EV71和CA16的分子流行病學監測，及時了解病毒的變異趨勢以及進化關系，對HFMD的預防控制、疫苗株的選擇以及腸道病毒基礎研究等具有重要意義。本次研究分析了蘇皖地區流行的EV71和CA16毒株的VP1基因特征以及系統進化研究，為EV71和CA16疫苗株的選擇提供了依據。

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