CKD患者尿沉渣中CCN2/CCN3 mRNA檢測的臨床意義探討

陳瓏，高民，劉丹，倪海峰，曹玉涵，劉宏，張建東，劉必成

(東南大學附屬中大醫院腎內科，腎臟病研究所，東南大學醫學院，江蘇南京 210009)

慢性腎臟疾病(CKD)已被廣泛地認為是威脅公眾健康的重大疾病［1-2］，CKD的進展表現為腎功能的下降和腎單位的破壞，而腎功能的下降通常在腎實質損傷之后，取決于殘余腎單位的代償能力［3］。因此，探究腎實質的結構損傷比測定腎功能的標記物如血肌酐更為重要。

腎活檢是確認腎臟病理變化的有效手段，但它有不容忽視的風險、并發癥和局限性［4］。基于此原因，已有大量的研究投入到尋找替代方法來監測腎臟病變進展［5］。例如白蛋白尿已證實為監測糖尿病腎病進展的可靠指標［6］，但是也有相當多的證據顯示，蛋白尿或白蛋白尿并不是監測非糖尿病腎病的理想指標［7-8］，因此，尋找出其他生物標記物來監測非糖尿病腎病患者腎損害進展具有十分重要的意義［5］。

近來，測定尿中目的基因mRNA的表達已成為監測各種腎臟疾病的有效方法。例如，Li等研究發現尿沉渣穿孔素和顆粒蛋白酶B mRNA的測定可成為診斷腎移植后急性排斥反應的有效無創檢測手段［9］，最新的研究提示這種基于mRNA檢測的技術方法亦可臨床應用于評估小管間質纖維化及足細胞的損傷等［10-13］。我們前期的研究表明，結締組織生長因子是重要的致腎纖維化因子，因此，本研究擬探討非糖尿病性慢性腎臟疾病(CKD)患者尿沉渣中CCN2/CCN3mRNA表達與腎小球組織病理學變化之間的關系。

1 資料和方法

1.1 病例選取和一般資料

35例CKD患者來自于東南大學附屬中大醫院，病例診斷標準參照NKF KDOQI指南2000。選擇標準為:存在蛋白尿且(或)評估腎小球濾過率 GFR≤60 ml·min－1。淘汰標準為:感染、其他全身系統性疾病癥狀體征者、取樣前2周內使用血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素受體拮抗劑(ARB)類藥物。患者分為兩組:輕度蛋白尿［蛋白尿≤1 g·(24 h)－1，n=13］和中重度蛋白尿［蛋白尿 ＞1 g·(24 h)－1，n=22］。正常對照組12例來自于體檢中心，納入標準為:年齡＞40歲，無高血壓、糖尿病，無臨床或實驗室證明患有CKD。臨床資料包括體重、收縮壓、24 h尿蛋白定量、腎小球濾過率估算值(eGFR)，eGFR計算法參照Ma等提出的適合于中國人體質的計算方程［14］。

1.2 尿液標本采集和RNA提取

尿液標本采集沿用先前文獻發表的方法［11］，即在患者入院的第1天或者參加體檢時收集晨尿標本。然后4℃下3 000 g離心30 min，收集沉渣，用1.5 ml經DEPC處理過的PBS重新懸浮后再次4℃下13 000 g離心5 min。有部分尿沉渣進行細胞病理學檢查，余下的沉渣溶入1.0 ml的RNAiso Plus(TAKARA，Dalian，China)，在－80℃下保存待檢。

總RNA提取按照廠家(TAKARA)試劑說明書進行，RNA的完整性通過RNA電泳檢測。RNA的濃度和純度使用 nanodrop2000(Thermo，Wilmington，USA)檢測。只有RNA樣本吸光度比值(260/280)大于1.8才能進行下一步研究。

1.3 逆轉錄和Real-time PCR

根據試劑說明書進行，在逆轉錄過程中加入同樣數量的模板RNA和PrimeScriptTMRT酶(TAKARA)，隨即置于 Bio-Rad thermal cycle(Bio-Rad，CA)，按照程序37℃15 min、85℃ 5 s進行逆轉錄工作，然后加入RNase H(invitrogen，NY)以減少RNA殘留。得到的cDNA用Nanodrop 2000檢查濃度和純度。

本研究中，CCN2和CCN3mRNA的相對定量使用ABI Prism 7300序列檢測系統(Applied Biosystems，California，USA)。人GAPDH作為看家基因，引物序列如下:CCN2 F 5'-GGA AAA GAT TCC CAC CCA AT-3';CCN2 R 5'-TGC TCC TAA AGC CAC ACC TT-3';CCN3 F 5'-TAA ACT GAG GCC CAA AGC AC-3';CCN3 R 5'-TGG CCC AAG GAT AAG TTT TG-3'。根據操作指南為Real-time PCR(Applied Biosystem，CA)加入SYBRGRYN master。所有樣本分3份，至少進行兩次檢測。PCR反應分兩步驟進行:95℃ 30 s、95℃5 s，然后60℃ 31 s(40個循環)。記錄解離曲線DC和解鏈溫度 Tm，使用 Sequence Detection Software version 1.4(Applied Biosystems，CA)分析結果。目標基因的相關基因表達由標準曲線法定量。各基因的PCR前產物作為標準，在10次連續稀釋下制定標準曲線。標準曲線包含于整個PCR流程。目標基因和看家基因的反應式豐度作為評估各基因的表達強度的指標，對照組使用ddH2O在整個流程中呈陰性。兩次使用解鏈曲線和電泳法確認PCR產物的特異性。

1.4 腎活檢標本的形態學測定

腎臟活體標本經過PAS染色，按照前述方法［15］使用計算機輔助方法進行形態學測定分析腎小球胞外基質增生情況。簡述為:使用 Leica microscope system(Germany)對所有腎臟標本的腎小球進行40倍成像，ImageJ軟件分析腎小球的PAS染色陽性比例。上述程序由兩名腎臟病理醫生獨立進行。

1.5 統計學處理

使用Graph pad Prism 5.01進行分析，所有數據均以±s格式表示，除非其他特殊需說明的情況。3個組的基本數據進行單相方差分析(ANOVA)，基因表達和腎小球病理評分的關聯性分析使用Spearman rank-order correlation。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 受試人群基本臨床參數

受試人群的基本特征見表1。正常對照組和非糖尿病CKD組之間年齡、體重、性別等差異無統計學意義，然而CKD組患者平均尿蛋白量明顯高于正常對照組［(2.28 ±0.44)vs.(0.043 ±0.017)g·(24 h)－1，P ＜0.000 1］。

表1 受試者臨床基本數據±s)Tab 1 Primary characteristics of the study subjects( ± s)

表1 受試者臨床基本數據±s)Tab 1 Primary characteristics of the study subjects( ± s)

組 別 n臨床基本數據年齡/歲 體重/kg 性別(男∶女) 尿蛋白/g·(24 h)－1 eGFR/ml·min－1·1.73 m－2收縮壓/mmHg正常對照組 12 42.2 ±8.2 57.5 ±7.8 12(7∶5)0.043 ±0.017 90.76 ±19.9 119.8 ±17.5 CKD 患者組 35 41.3 ±8.9 58.1 ±11.6 35(19∶16) 2.280 ±0.440 98.39 ±37.1 127.3 ±14.6 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 0.000 1 ＞0.05 ＞0.05

2.2 尿沉渣CCN2和CCN3mRNA的表達

我們首先測定了所有受試者的尿沉渣中CCN2和CCN3mRNA的水平。如圖1所示，在正常對照組中亦能檢測出CCN2和CCN3mRNA的表達。檢測中發現，CKD組的兩種分子的mRNA水平較正常對照組顯著升高(CCN2:P=0.005 2，CCN3:P=0.000 1)。提示這兩種分子標記物可以很好地將正常對照和CKD患者的尿液區分出來。

圖1 CKD患者組及正常對照組尿沉渣CCN2和CCN3的表達Fig 1 Urinary CCN2，CCN3 expression in CKD patients and health controls

2.3 以尿蛋白分級的CKD患者尿mRNA表達水平

我們研究了根據尿蛋白程度分級的CKD患者尿中的CCN2和CCN3mRNA表達水平是否一致。35例CKD患者分為兩組:尿蛋白≤1 g·(24 h)－1和 ＞1 g·(24 h)－1。結果顯示，這兩組CKD患者尿CCN2和CCN3mRNA水平均較正常對照組顯著增多(CCN2:P=0.020 4;CCN3:P=0.000 6)，而兩組CKD患者尿中的CCN2和CCN3mRNA表達水平并無顯著性差異，提示尿液CCN2和CCN3mRNA水平并不隨尿蛋白嚴重程度而增加。見圖2。

圖2 不同尿蛋白組CKD患者尿沉渣CCN2和CCN3 mRNA的表達Fig 2 Urinary CCN2，CCN3 mRNA expression among CKD patients with different level of proteinuria

2.4 腎小球組織病理分級和尿CCN2、CCN3mRNA表達水平及兩者之間比率的相關性研究

35例患者中，17例接受了腎活檢(其中7例IgA腎病，5例局灶節段性腎小球硬化，3例狼瘡性腎炎，2例特發性膜性腎病)。我們進行了腎小球胞外基質增生的分級與CCN2、CCN3的關聯分析及兩者比值的關聯分析。如圖3所示，可見尿CCN2mRNA與胞外基質增生分級無顯著相關性，而尿CCN3mRNA和腎小球胞外基質增生呈現負相關(r=－0.614 6，P=0.008 7)。更重要的是，尿CCN2和CCN3mRNA的比值與腎小球胞外基質增生分級密切相關(r=0.647 2，P=0.005)。另外我們發現兩組CKD患者中尿蛋白程度與腎小球PAS評分之間無顯著相關性，這更進一步證明尿蛋白的程度不適合作為評估非糖尿病CKD患者病理學改變的生物學指標。

2.5 腎臟活檢標本的形態學測定結果

見圖4。

3 討 論

在本研究中，我們揭示了CKD患者的尿CCN2、CCN3mRNA顯著地高于正常對照組，然而在蛋白尿水平不同的CKD患者尿中，這兩種標記物的mRNA表達水平沒有顯著差異。雖然如此，我們發現尿CCN3mRNA的水平與腎小球病理分級呈顯著負相關。此外，尿CCN2、CCN3的比值與腎小球硬化程度關系更加密切(圖5)，提示我們可以采用這種無創檢查手段監測非糖尿病CKD患者腎小球病理變化的情況。

先前的研究證實，CCN2在病變的腎臟中表達增加，并且可以在血液和尿液等體液中檢測到［16］。尿CCN2蛋白水平與糖尿病腎病的嚴重程度相關，但易被多種干預情況影響［17］。我們的研究清楚地顯示了CKD患者尿CCN2mRNA顯著增高，更證實了CCN2在腎臟纖維化的發病機制中起重要作用這一觀點。而近期也有數據揭示，在腎小球腎炎和糖尿病患者中損傷的腎小球CCN3的表達增加［18］。與此一致，我們發現CKD患者尿CCN3mRNA較正常對照組顯著增高。

為了研究這兩種標記物能否作為監測腎小球病理改變嚴重程度的指標，我們研究了不同程度蛋白尿患者尿CCN2和CCN3mRNA水平。結果顯示，不同程度的蛋白尿患者尿CCN2和CCN3mRNA表達水平沒有顯著性差異，同時我們的研究不能證實 CCN2或CCN3mRNA與eGFR降低之間的有無相關關系(數據未顯示)。這一結果似乎與我們先前的研究及他人的研究結論相矛盾，即在人類腎臟病或實驗動物模型中，尿液或腎組織CCN2蛋白的表達與腎臟纖維化密切相關［17，19］。因此，本研究提示:第一，特定分子的尿mRNA表達與其尿中的蛋白水平無明確相關性［20］。尿mRNA主要來源于尿沉渣中脫落細胞和外染色體結構，而尿中分子的蛋白水平取決于腎小球濾過和小管重吸收的共同作用。第二，當前的尿mRNA的測定技術采用看家基因來進行標準化，應該能排除其他因素干擾［21］。而尿蛋白水平為總體水平，不能將蛋白尿和白蛋白尿區分測定，這種情況與Goumenos的研究也相類似，他們的研究表明，尿TGF-β1mRNA而非TGF-β蛋白與腎小管間質纖維化密切相關［20］。

圖3 尿沉渣CCN2、CCN3 mRNA及兩者的比值與腎小球硬化的相關分析Fig 3 Correlation between Urinary CCN2，CCN3 mRNA ，their ratio and glomerulosclerosis

本研究最重要的發現是，在17例接受腎活檢的患者中尿CCN3mRNA與腎小球硬化程度呈負相關。若用CCN2/CCN3mRNA之值替代CCN3mRNA則相關程度更為密切，結合既往研究工作我們認為，CCN2可能作為腎小球損傷病理變化的啟動因子，而CCN3沒有足夠的拮抗作用，最終導致腎小球硬化的發生。

受限于醫療資源和其他原因，我們有很多CKD患者不能或不愿意接受腎活檢。如果考慮到在中國和世界上其他不發達地區CKD的高發病率，那么我們會意識到除檢測尿蛋白外，還迫切需要找到另外一種來監測腎臟病變情況的方法。先前我們課題組在糖尿病腎病模型的研究中首次應用抗體芯片技術，證實尿液中某些細胞因子水平的變化與糖尿病腎病的發生發展和轉歸密切相關，為監測糖尿病腎病病變情況提供了新的途徑［22］。而在本臨床研究中，我們的研究結果正是提供了一種可行性很強的替代手段，即可以通過檢測CKD患者尿液CCN2/CCN3mRNA來檢測腎臟病變的進展。

本研究也有些不可避免的局限性:第一，我們的研究結果需要在大樣本的不同原因引起的CKD患者群中進一步確認。第二，我們的研究數據來自于初診未接受醫療干預的患者。因此，下一步可將更多的精力用于研究常用的治療藥物如甾類、抗高血壓藥物是否能影響上述的研究結果。

總之，本研究證實了尿沉渣中CCN2/CCN3mNRA與非糖尿病的CKD患者的腎小球硬化程度密切相關，提示該項檢測可能成為非創傷性評估非糖尿病CKD患者腎臟病變程度的有效檢查手段。

圖4 不同程度的腎小球硬化典型圖片及病理評分 ×400Fig 4 Representativeimagesand pathologicscoreof glomeruli with different degrees of sclerosis ×400

圖5 CKD患者尿沉渣中CCN2/CCN3mRNA的比值研究Fig 5 Ratio of urinary mRNA of CCN2，CCN3 in CKD patients

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