PI3K-Akt信號通路對人大腸癌hct-8/FU耐藥細胞P-GP表達和耐藥性的影響

張勁遠，張銀旭，張俊華

(遼寧醫學院附屬第一醫院普通外科，遼寧錦州 121001)

近年來一些細胞信號分子的抑制劑已經用于腫瘤的臨床治療，針對PI3K-Akt信號通路中多個分子抑制劑(如Wortmannin和LY294002)在體外和體內實驗中都有抗腫瘤活性，并且可增加腫瘤細胞對其他靶點治療、化療和放療的敏感性［1］。近年研究發現，腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導致腫瘤化療失敗的重要原因［2］。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-GP)是引起MDR的主要分子，但因其調控機制不明，至今仍無法克服其介導的耐藥。研究表明，P-GP的功能受多種信號蛋白的調節［3-5］，磷脂酰肌醇3-激酶-(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和其下游分子蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt)所組成的PI3K-Akt信號通路是調控細胞生存的重要信號轉導通路之一。最新研究證實，激活前列腺癌細胞PI3K-Akt通路，可上調P-GP的表達［6］，所以阻滯PI3K-Akt信號傳導路徑可能影響P-GP的活性表達，并對腫瘤細胞耐藥性產生影響。我們以結腸癌耐藥細胞株為模型，探討抑制PI3K-Akt通路對結腸癌hct-8/FU P-GP蛋白表達的影響及對耐藥細胞耐藥性的逆轉作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人結腸癌細胞株hct-8及人結腸癌MDR細胞株hct-8/FU(南京凱基生物科技公司)，5-FU(天津金耀氨基酸有限公司)，PI3K抑制劑LY294002(Sigma公司)，PI3K、Akt、P-Akt、P-GP 抗體(Cell Signaling 公司)，鼠抗人β-actin多克隆抗體(博士德生物技術公司)，蛋白質印跡法檢測儀Bioshine(上海歐翔科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞株培養及分組 在含100 ml·L－1小牛血清的 RPMI 1640 培養液中，37 ℃，50 ml·L－1CO2飽和濕度條件下連續培養。hct-8采用藥物持續接觸濃度遞增誘導法，直到能在含5-FU濃度為40 mmol·L－1的培養基中穩定生長，并命名為hct-8/FU。實驗設hct-8、hct-8/FU及hct-8/FU加藥(加LY294002)組3組，培養箱中培養。

1.2.2 藥物敏感性測定 將對數生長期hct-8、hct-8/FU和hct-8/FU加藥組細胞接種于96孔培養板，采用MTT法連續檢測7 d，繪制細胞生長曲線。

不同濃度梯度組的5-FU分別作用于hct-8和hct-8/FU細胞，每組設6個復孔，MTT法計算IC50值，用酶標儀(波長490 nm)測吸光度(A)值，計算細胞抑制率。細胞抑制率=(對照組A值－實驗組A值)/對照組A值×100%。用LY294002預處理上述各實驗組細胞，觀察其耐藥性的變化。hct-8及hct-8/FU組加入 LY294002 的終濃度為 20 μmol·L－1。

1.2.3 免疫印跡法檢測 PI3K、Akt、P-Akt、P-GP 蛋白表達 于對數生長期分別收獲各組細胞進行SDSPAGE 凝膠電泳、半干法轉印［7］，以 PI3K、P-GP、PAkt、Akt單抗(1∶400稀釋)作為一抗，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶800)，孵育后ECL顯色(按試劑盒說明書操作)。

1.3 統計學處理

各實驗重復3次，實驗數據用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hct-8、hct-8/FU和hct-8/FU加藥組的生長曲線

細胞以貼壁方式生長，hct-8細胞的倍增時間為33.50 h，hct-8/FU細胞為48.79 h，hct-8/FU加藥組為41.70 h。以生長時間為橫坐標、細胞數量為縱坐標繪制細胞生長曲線如圖1。

圖1 3組細胞生長曲線

2.2 不同濃度5-FU下各組細胞的生長抑制率及IC50

各組細胞生長抑制率詳見圖2。hct-8細胞對5-FU的 IC50值為(43.2±1.4)mg·L－1;hct-8/FU 細胞IC50值為(516.00 ± 20.03)mg·L－1，耐藥倍數為11.9;HCT-8/FU加藥組IC50值為(58.2±4.3)mg·L－1，耐藥倍數為 1.37，逆轉指數為 8.86。LY294002對hct-8和hct-8/FU細胞增殖有顯著抑制作用，LY294002 40 μmol·L－1聯合 5-FU 作用時，各濃度組抑制率與單用5-FU相比差異均有統計學意義，可以看出，LY294002聯合5-FU給藥比單用5-FU對hct-8和hct-8/FU細胞生長的抑制作用要強。

圖2 不同濃度5-FU下hct-8、hct-8加藥、hct-8/FU和hct-8/FU加藥組細胞的生長抑制率

2.3 免疫印跡法檢測5-FU、LY294002對Hct-8和Hct-8/FU細胞 PI3K、Akt、P-Akt和 P-GP表達的影響

利用蛋白質印跡法半定量分析進一步驗證PI3K、Akt、P-Akt和P-GP在hct-8和hct-8/FU細胞中的表達情況，結果顯示:在hct-8和hct-8/FU細胞中，hct-8細胞對照組PI3K、Akt、P-Akt及P-GP蛋白相對濃度值均低于hct-8/FU細胞對照組，差異均有統計學意義(t值分別為 26.005和 23.477，均 P＜0.05)，加用LY294002 后 PI3K、Akt、P-Akt及 P-GP 表達均低于未加藥組。該結果提示，抑制PI3K-Akt通路后可能影響下游蛋白P-GP表達進而與hct-8、hct-8/FU細胞間的耐藥性差異有關，見圖3。

圖3 蛋白質印跡法檢測hct-8、hct-8/FU、hct-8/FU加藥組3組細胞 P-Akt、PI3K、Akt、P-GP 的表達

3 討 論

PI3K-Akt信號通路在腫瘤的發生、發展、治療及轉歸中發揮重要作用。近年研究顯示，PI3K-Akt通路抑制劑Wortmannin能促進胃癌細胞BGC-823凋亡，增強抗腫瘤化療藥物足葉乙甙和多柔比星的療效，提示PI3K-Akt通路失活與胃癌化療敏感性有關［7］;同時研究［8-9］表明，PI3K-Akt信號途徑還與腫瘤MDR密切關聯，PI3K-Akt的激活可以導致進展期前列腺癌細胞MDR蛋白1(MRP1)的表達和繼發MDR的發生;在耐藥的結腸腺癌細胞HT29RDB中，PI3K-Akt信號途徑的阻滯劑LY294002與阿霉素聯合使用能夠在MRP1介導的耐藥機制中發揮治療作用，可使細胞內阿霉素藥物濃度增加3倍以上。

PI3K-Akt通路已經成為腫瘤治療的新靶點，P-GP在腫瘤治療過程中對腫瘤細胞耐藥性的產生發揮重要作用，腫瘤細胞中P-GP利用ATP水解釋放的能量降低細胞內藥物的濃度，從而產生耐藥性。關于結腸癌細胞P-GP的表達調控是否依賴于PI3K信號通路的研究目前報道很少，進一步弄清這一信號通路不僅對更清楚地闡明大腸癌化療耐藥的分子機制具有重要的理論意義，而且對防治結腸癌的耐藥性產生和提高耐藥病人化療效果具有重要的實用價值。結腸癌細胞的耐藥機制目前還不完全清楚，研究表明，Akt能夠通過磷酸化其下游的多種作用底物促進腫瘤細胞的生長、增殖，抑制細胞凋亡，提高細胞的缺氧耐受，促進血管生成，腫瘤細胞侵襲、轉移以及對化療和放療的抵抗［10］。Zhang 等［11］發現下調 Akt表達可抗腫瘤治療。

本研究顯示，hct-8/FU 細胞中 PI3K、Akt、P-Akt、P-GP蛋白表達水平高于hct-8細胞，應用LY294002抑制PI3K-Akt蛋白表達可增強hct-8細胞對5-FU的藥物敏感性，特別是在hct-8/FU細胞，應用LY294002抑制PI3K-Akt蛋白表達后細胞對5-FU藥物敏感性接近其親本(hct-8細胞)水平，提示PI3K-Akt信號通路異常與結腸癌對5-FU耐藥有關，抑制PI3K-Akt信號通路能逆轉結腸癌對5-FU耐藥表型。此外，我們應用LY294002抑制PI3K-Akt信號通路后，蛋白質印跡法檢測hct-8和hct-8/FU細胞中耐藥蛋白P-GP表達降低，提示LY294002可能通過抑制PI3K-Akt通路激活進而抑制下游蛋白分子P-GP表達從而逆轉結腸癌細胞耐藥。

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