基于光子懸浮列陣多元檢測腫瘤標志物的初步研究

盧穎輝，何杰，田小強，常立功，黃培林

(1.東南大學醫學院，江蘇 南京 210009;2.安徽醫科大學附屬省立醫院 病理科，安徽合肥 230000)

由于單個標志物往往不能準確診斷某種腫瘤，所以研發新型具有高通量聯合檢測多種腫瘤標志物的方法就顯得格外重要。目前常用的傳統的腫瘤標志物檢測方法常只能檢測單個腫瘤標志物，在需檢測多個標志物時會造成資源浪費［1-2］。相對于傳統的檢測方法，多元檢測技術具有高通量、高靈敏度、節省待測樣本、縮短檢測時間、降低檢測成本等優勢［3］。

本研究采用基于膠體晶體微球編碼載體的多元檢測技術檢測腫瘤標志物。這種微列陣的載體是二氧化硅膠體晶體微球(silica crystal colloidal spheres，SCCBs)。這些載體的編碼是源于它們結構周期性的特有的反射峰，所以不會有諸如褪色、漂白、粹滅以及化學不穩定等問題［4-5］。另外，由于沒有染色和與熒光相關的物質存在，所以SCCBs的背景很低［6-7］。在本研究中，我們在成功構建SCCBs微列陣的基礎上，應用雙抗夾心法對人膠質瘤細胞株蛋白提取物中的Bcl-2、p21蛋白進行檢測。檢測結果與傳統ELISA方法進行比對，初步探討基于SCCBs的微列陣多元檢測技術的可行性、高通量及其高靈敏度等特點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人膠質瘤細胞株SHG-44由蘇州大學提供，DMEM高糖培養基在細胞恒溫培養箱培養。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人p21抗體、異硫氰酸熒光素(FITC標記)標記的二抗均購自BD公司，牛血清蛋白(BSA)購自Sigma公司，5%的PBS緩沖液(pH 7.4)、SCCBs由東南大學生物電子國家重點實驗室提供，細胞裂解液以及CBA蛋白定量試劑盒均購自碧云天生物技術研究所，人Bcl-2、p21蛋白ELISA試劑盒均購自南京迪堯生物技術公司。

1.1.3 主要儀器 金相顯微鏡(OLYMPUS BX51)、熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71)、高靈敏度彩色CCD攝像頭(Evolution MP 5.0)、高靈敏度冷CCD(DP30)、光纖光譜儀(USB2000-FLG，QE65000)、細胞恒溫培養箱、酶標儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建SCCBs懸浮微列陣 通過預實驗摸出最合適的時間和溫度，標記上探針，構建最佳狀態的懸浮微列陣。探針分子是通過共價結合固定在SCCBs表面的。首先，SCCBs作親水處理，在濃硫酸與雙氧水7∶3的溶液中浸泡48 h，用純水洗干凈，烘干后用10%的G-PTMS甲醛溶液浸泡過夜，分別用甲醛和乙醇溶液洗，然后用純水洗干凈。SCCBs標探針。本研究用的10 μl體系每管都是10 μl、5 個微球。將10 μl的一抗加到EP管里，4℃過夜。

1.2.2 免疫檢測 應用雙抗夾心法，首先用不同濃度的蛋白標準液測量標準曲線;再用同一條件的微列陣定量檢測從人膠質瘤細胞提取的總蛋白中的Bcl-2、p21蛋白。檢測在同一試管中進行。

將孵育過夜的微球用PBS緩沖液洗3～4遍，每次5 min;加5%的BSA蛋白溶液封閉2 h，條件是37℃振蕩搖勻;封閉過后的微球要用PBS緩沖液洗4～5遍，每次5 min;再加待測蛋白標準品或者細胞蛋白樣品孵育30 min，37℃振蕩搖勻;標準品的配制與樣品的稀釋都用PBS緩沖液;然后用PBS緩沖液洗4～5遍，每次5 min;洗完后孵育 FITC標記的二抗30 min，37℃振蕩搖勻;孵育過后用PBS緩沖液洗4～5遍，每次5 min。在熒光顯微鏡下觀察并記錄熒光。

在進行多元腫瘤標志物檢測時，不同編碼的SCCBs表面固定各自的探針分子，并被混合在一起置于同一試管內。

ELISA檢測，繪制標準曲線，分別檢測蛋白提取物中的Bcl-2、p21蛋白，所有實驗重復3次以上。

1.3 統計學處理

使用SPSS統計軟件分析，組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 基于SCCBs的懸浮列陣的構建

如圖1所示，5種光子 SCCBs的反射峰分別是447、510、562、592 和 617 nm，我們從 5 種微球中選出兩種反射峰居中而又有一定差別的微球(微球反射峰分別是510、592 nm)用于下一步研究。

圖1 5種微球的光譜圖Fig 1 Reflection spectra of the five kinds of SCCBs

2.2 用懸浮微列陣方法繪制標準曲線

用懸浮微列陣方法檢測得到Bcl-2和p21的線性范圍分別是9 ～180 ng·ml－1和0.05 ～1 ng·ml－1。

圖2、3為Bcl-2、p21蛋白的濃度標準曲線。跟傳統的免疫分析結果一致，呈現非線性，將其進行曲線擬合處理。結果分析顯示，以上兩種腫瘤標記物的檢測下限(信噪比為3σ)分別為1 ng和0.049 ng。基于SCCBs載體的多元檢測方法在腫瘤分析中的靈敏度以及檢測范圍適合臨床應用。

圖2 Bcl-2的濃度與熒光強度關系曲線圖Fig 2 Calibration plots of fluorescence intensity vs Bcl-2 tumor marker concentrations

圖3 p21的濃度與熒光強度關系曲線圖Fig 3 Calibration plots of fluorescence intensity vs p21 tumor marker concentrations

2.3 樣品檢測結果

對30份細胞總蛋白樣本進行檢測并對每個標記物檢測的數據進行線性回歸分析，得到如圖4所示的分析結果關系圖。由圖中我們可以發現，基于SCCBs編碼載體所獲得的腫瘤標記物檢測結果和商業化方法獲取的檢測結果具有較高的一致性。結果如下所示(x列:ELISA;y列:光子懸浮列陣):

p21:y=0.928 1x+0.110 7(R2=0.988 9)

Bcl-2:y=0.951 7x+5.403(R2=0.988 6)

圖4 基于SCCBs載體技術和ELISA樣本檢測結果 橫坐標為ELISA檢測結果，縱坐標為光子懸浮陣列技術檢測結果Fig 4 Correlation between the photonic suspension array and the standard ELISA method for the two tumor marker

這些數據進一步證明了我們開發的多元檢測技術與傳統的檢測方法一樣具有較好的分析可靠性。另外，基于SCCBs編碼載體的檢測方法消耗更少的樣品量，并可以在同一試管內完成兩種腫瘤標記物的檢測，極大地簡化了免疫檢測過程。

3 討 論

腫瘤標記物的檢測在癌癥的早期篩查、正確分型、治療評估及預后、復發預測等方面具有重要意義，特別是多種腫瘤標記物的聯合檢測，對臨床腫瘤的準確診斷至關重要［8-10］。目前常用的有效的檢測方法只能分別檢測某一種腫瘤標記物，常無法準確反映疾病的本質，臨床應用價值有待進一步探討。目前所采用的多元檢測的方法各式各樣，但是大多都是基于生物分子的固定和識別。為了同時區分不同的檢測事件，生物分子必須被編碼。但是生物探針分子的這種編碼其位置或者坐標必須是固定的，靶分子要到達探針分子位置并與之反應，這一過程受擴散速度的限制，因此這會影響靶分子和探針分子的反應速度，令檢測所需時間延長［11-12］。

近年來，將探針分子固定在微球表面的微列陣技術為多元檢測提供了巨大的技術支撐［13-14］。在本研究中，利用基于SCCBs編碼載體的多元檢測技術檢測腫瘤標記物，我們首先優化了腫瘤標記物探針分子在SCCBs表面的固定條件及微球表面探針與標記物反應的條件，提高了檢測靈敏度。我們研究了物理吸附的方法和化學偶聯的方法，結果發現，SCCBs高溫處理后其親水效果明顯，可以被水完全浸潤，這就導致了以疏水作用為主的探針分子在微球表面物理吸附的效率低下。另外，探針分子在微球表面吸附的變異系數也較高，導致檢測結果缺乏準確性。相比而言，以化學偶聯法在微球表面固定探針分子具有更高的穩定性及固定效率。從微球大小和反應時間等方面進行優化，我們發現，微球的熒光強度在孵育了30 min之后達到飽和。在反應時間方面，這種微列陣的雙抗夾心免疫孵育時間比傳統ELISA方法的1～3 h短很多，這是因為SCCBs有很高的比表面積，使免疫反應速度大大提高。在檢測所需要樣品的量方面，由于基于SCCBs的微列陣是在一個試管內同時檢測兩種微球，所以每管檢測樣品只需加10 μl，而ELISA方法只能1個孔測1種蛋白，所以要測兩種蛋白就要用20 μl的樣品。如果待測物再增多的話，基于SCCBs微列陣方法就會節省非常可觀的待測樣品。在檢測高通量方面，傳統的ELISA方法是單一檢測的，而本研究中的新方法有報道稱可以同時檢測上百種待測樣品。由于此技術是在1個試管內檢測多種標記物，使其檢測過程大大簡化，效率大大提高。

基于SCCBs的多元檢測技術與傳統的ELISA方法分別對人膠質瘤細胞蛋白提取物中Bcl-2蛋白、p21蛋白的檢測結果進行比對，顯示兩種方法檢測結果具有較高的一致性。此外，較之ELISA法，基于SCCBs的多元檢測方法可明顯降低樣品量，并可以在同一反應體系內完成多種腫瘤標記物的檢測，極大地簡化了免疫檢測過程。由此可見，基于SCCBs編碼載體的多元檢測技術在基因研究、藥物篩選、臨床診斷等方面具有廣泛的應用前景。在本研究中，一種新型的多元檢測方法被應用于腫瘤標記物的檢測，這種方法就是懸浮微列陣。SCCBs作為這種微列陣的載體，其表面是納米粒子，這樣可以大大減小空間位阻，提高反應動力學。因此，光子懸浮陣列特別適合檢測疾病診斷標記物，值得進一步完善和探索。

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