N-糖基化對KCNE1功能的影響

李小青，茅家慧，胡亞娥，施海燕，沈之君

(南通大學醫學院病理學與病理生理學系，江蘇南通 226001)

N-糖基化是蛋白翻譯后修飾的一種，對蛋白功能的正常發揮起重要作用。KCNE1為電壓門控性鉀離子通道Iks的調控亞基，KCNQ1為功能亞基。KCNE1不存在時，KCNQ1表現出快速激活和快速失活特征;在KCNE1調控下，通道表現為緩慢激活特征，失活速度減慢，并且通道電導率明顯增加4～7倍，電壓依賴性曲線右移。該通道參與心肌動作電位復極化［1］，尤其是在機體受到刺激后交感神經興奮的情況下發揮重要作用。臨床上，KCNQ1和KCNE1的突變可分別導致LQT1和LQT5［2］。因此，研究該通道的功能和調控對臨床治療相關疾病有重要意義。N-糖基化在KCNE1中的作用尚無系統研究。N-糖基化在KCNE1中功能的研究可增進對KCNE1功能調控的認識，并增加對Iks通道調控的理解，也為臨床上預防與KCNE1 N-糖基化有關的疾病，并為尋找新的治療靶點提供理論和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

人源KCNE1基因表達載體KCNE1-pcDNA 3.1:NIH Mammalian Gene Colletion(MGC);人源KCNQ1基因表達載體KCNQ1-PCI:同濟大學陳義漢教授惠贈;質粒體外表達細胞株HEK293B:上海細胞研究所;PNGaseF:New England Biolabs，貨號 P0704;點突變試劑盒(QuikChange?Lightning Site-Directed Mutagenesis試劑盒):Stratagene，貨號210518;KCNE1抗體:Santa Cruze，貨號sc-16796(WB 使用濃度1∶1 000，細胞免疫熒光使用濃度1∶100);KCNQ1抗體:Santa Cruze，貨號sc-20186(使用濃度1∶2 000);Goat anti-rabbit IgG(H+L):Thermo，貨號 31460(使用濃度 1∶5 000);Rabbit anti-goat IgG(H+L):Thermo，貨號31402(使用濃度1∶5 000);Alex Flour?488 donkey anti-goat:Invitrogen，貨號A11055(使用濃度1∶500);脂質體FuGENE?HD Transfection Reagent:Roche，貨號 04709705001;Dynal beads-ProteinG:Invitrogen，貨號 100.04D。

1.2 方法

1.2.1 PNGaseF 消化 KCNE1 實驗

PNGaseF(peptide-N-glycosidase F):特異水解N寡糖-肽連接鍵，去除N-糖基化糖鏈。KCNE1蛋白裂解液(蛋白20 μg)按照使用說明處理后加入2 μl PNGaseF，37℃孵育2 h。然后將產物加蛋白上樣緩沖液處理后經蛋白質印跡法分析。本研究中使用的SDS-PAGE濃度均為:分離膠濃度15%，濃縮膠濃度5%。

1.2.2 KCNE1 N-糖基化位點突變體質粒的構建與表達

1.2.2.1 突變體質粒構建 以野生型KCNE1-pcDNA 3.1為模板，按照點突變試劑盒操作方法構建KCNE1-N5Q、KCNE1-N26Q和 KCNE1-N5，26Q 3個突變體。KCNE1-N5Q上下游引物為:上游引物5'-CCAGGATGA TCCTGTCTCAAACCACAGCGGTGACGC-3'，下游引物 5'-GCGTCACCGCTGTGGTTTGAGACAGGATCATCCTGG-3';KCNE1-N26Q上下游引物為:上游引物5'-GTTCAGC AGGGTGGCCAAATGTCGGGCCTGGC-3'，下 游 引 物5'-GCCAGGCCCGACATTTGGCCACCCTGCTGAAC-3'。

1.2.2.2 突變體質粒表達 將KCNE1野生型及3個突變體，按照8 μl脂質體/4 μg KCNE1的比例，分別轉染至已在60 mm培養皿中培養12～24 h的HEK293B細胞中，培養36 h后提取蛋白，經蛋白質印跡法分析。

1.2.3 KCNE1 N-糖基化突變體亞細胞定位分析實驗

細胞免疫熒光實驗檢測KCNE1 N-糖基化突變體亞細胞定位。方法:將HEK293B提前12 h培養在鋪有蓋玻片的12孔板上;按2 μl脂質體/1 μg KCNE1的比例，將野生型和突變體分別轉染細胞;36 h后進行免疫染色:4%多聚甲醛固定30 min;0.2%Triton-X100的PBT通透細胞膜，15～30 min;KCNE1抗體孵育，4℃過夜;PBST漂洗3次，10 min·次－1;donkey anti-goat熒光Ⅱ抗孵育，室溫2 h;PBST漂洗3次，10 min·次－1;在細胞片上滴 80% 甘油約 20 μl，然后其上覆蓋蓋玻片，室溫放置15 min;制好的細胞玻片在熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.2.4 KCNE1 N-糖基化突變體與KCNQ1相互作用分析

通過KCNE1 N-糖基化突變體與KCNQ1的免疫共沉淀實驗檢測KCNE1 N-糖基化突變體與KCNQ1相互作用。HEK293B在60 mm培養皿中培養12～24 h后，細胞密度達到70%～80%，以8 μl脂質體/(2 μg KCNQ1+2 μg KCNE1)的轉染比例，將野生型及突變體分別與KCNQ1轉染細胞;細胞轉染36 h后依次進行以下操作:以200 μl RIPA裂解液提取細胞總蛋白;在200 μl蛋白裂解液中加入20 μl KCNQ1的抗體，4℃緩慢搖動過夜;向上述反應混合物中加入50 μl Dynal beads-ProteinG，4℃緩慢搖動混合物2 h，然后經PBS漂洗3次;利用磁力架收集磁珠-抗原-抗體復合物，PBS漂洗3次，得到沉淀物(磁珠-抗原-抗體);用60 μl上樣緩沖液將沉淀懸起，輕輕混勻;將上述樣品煮沸10 min，然后以磁力架棄去磁珠，上清經過蛋白質印跡法檢測KCNE1。

2 結 果

2.1 KCNE1糖基化位點的鑒定

KCNE1含有129個氨基酸。N-糖基化的氨基酸的序列特征是Asn-X-Ser/Thr(X代表除脯氨酸外的任何一種氨基酸)，天冬酰胺作為糖鏈受體。根據上述條件分析，KCNE1上第5位(N5)和第26位(N26)符合條件(圖1，加粗斜體字母顯示)，說明KCNE1可能存在N-糖基化。為進一步確定KCNE1存在N-糖基化，使用特異的去除 N-糖基的酶 PNGaseF消化KCNE1，蛋白質印跡法檢測結果(圖2)顯示:KCNE1經消化后，3條條帶只剩下分子質量最小的一條帶，證明KCNE1存在N-糖基化，N5和N26是可能的N-糖基化位點。

圖1 KCNE1“Asn-X-Ser/Thr序列”分析圖Fig 1 “Asn-X-Ser/Thr”sequencing analysis of KCNE1

圖2 KCNE1經PNGaseF去N-糖基后蛋白免疫印跡圖Fig 2 Western blot of KCNE1 de-N-glycosylation treatment using PNGaseF

2.2 KCNE1 N-糖基化突變體的構建及表達分析

將KCNE1 5位和26位的N突變為Q(谷氨酰胺，與天冬酰胺分子結構類似，但不能被N-糖基化修飾)，得到KCNE1-N5Q(單點突變)、KCNE1-N26Q(單點突變)和KCNE1-N5，26Q(聯合突變)3個突變體。蛋白質印跡法檢測結果(圖3)顯示:野生型KCNE1表現為3條條帶，但17kDa及26kDa與17kDa之間的條帶因上樣量較少，表現不明顯(參考圖2)。與野生型相比，兩個單點突變體均減少1條條帶，而聯合突則僅保留1條條帶，說明N5和N26為KCNE1的兩個糖基化位點。同時，圖3顯示 KCNE1-N5Q和 KCNE1-N5，26Q表達相對減少，而KCNE1-N26Q的表達與野生型表達豐度接近。

圖3 KCNE1及其N-糖基化位點突變體蛋白免疫印跡分析圖Fig 3 Western blot of KCNE1 and the N-glycosylation mutants

2.3 KCNE1 N-糖基化突變體亞細胞定位分析

細胞免疫熒光結果(圖4)表明:野生型KCNE1在細胞質內的分布較為均勻。與野生型相比，KCNE1-N26Q在細胞質內分布較少，主要分布在細胞核周圍的內質網區域，表現為顯著的蛋白囤積特征(白色↑↑所示)，KCNE1-N5Q與KCNE1-N5，26Q則該特征表現不明顯(白色↑所示)。突變體不同程度的蛋白囤積現象，可能與突變體表達豐度有關系，如圖3所示:KCNE1-N26Q表達量較大，而KCNE1-N5Q和KCNE1-N5，26Q表達減少，因此前者可表現出明顯的內質網區域蛋白囤積特征，后兩者則不明顯。上述結果顯示，突變體在細胞內的轉運出現障礙，說明N-糖基化參與了蛋白轉運過程，其中N26Q的糖基化在蛋白的轉運中的作用最為突出。

圖4 KCNE1及其N-糖基化突變體細胞免疫熒光圖Fig 4 Immunofluorenscent studies of KCNE1 and the N-glycosylation mutants

2.4 KCNE1 N-糖基化突變體與KCNQ1相互作用分析

采用免疫共沉淀的方法探究N-糖基化位點突變體KCNE1與KCNQ1的相互作用是否發生改變。結果(圖5)顯示:與野生型類似，KCNE1 N-糖基化突變體均能與KCNQ1結合，說明N-糖基化修飾在KCNE1與KCNQ1的相互作用中不起重要作用。但N-糖基化修飾是否影響兩者之間的結合能力，尚需進一步蛋白定量分析。

圖5 KCNE1及其N-糖基化突變體與KCNQ1免疫共沉淀實驗結果圖Fig 5 Co-immunoprecipitation of KCNE1 and its N-glycosylation mutants with KCNQ1

3 討 論

N-糖基化在蛋白的功能中發揮著重要角色。表現在:加強蛋白質穩定性使其能夠抵抗消化酶的作用;參與蛋白轉運、信號轉導［3］;幫助蛋白的正確折疊和組裝;也參與蛋白的分泌過程，例如促進人類生長因子的分泌［4］。有研究報道糖基化參與了大鼠血管平滑肌細胞骨保護素mRNA表達調節［5］。在離子通道中的作用表現在兩方面:調控蛋白的膜表達［6-7］;調控離子通道的功能，例如通道激活和門控特性［8］;近期有研究發現:N-糖基化依賴性阻斷是藥物引起心律失常的一種新的機制［9］。本研究探究了其對KCNE1功能的影響。實驗結果顯示，N-糖基化位點參與了蛋白的轉運過程，并且呈現位點功能的差異性，KCNE1-N26Q蛋白在細胞內發生囤積現象明顯，說明N26對蛋白的轉運起關鍵作用。免疫共沉淀結果顯示突變體仍能與KCNQ1結合，說明KCNE1 N-糖基化修飾對兩者的相互作用不起關鍵作用，但N-糖基化修飾是否影響二者的結合能力尚待進一步蛋白定量分析。以上研究是基于體外實驗的結果，N-糖基化對KCNE1功能的影響在生物體內可能更為復雜。有研究報道，KCNE1也參與調控Ikr通道，KCNE1-D85N突變體會導致HERG通道電流減小85%［10］，因此其蛋白的N-糖基化功能失調可能影響HERG通道或其他與其相關的通道的功能。KCNE1-T7I是臨床上發現的突變位點［11］，可導致Jervell and Lange-Nielson Syndrome(耶韋爾和朗格-尼爾森綜合征，JLNS)。第7位(T7)是KCNE1蛋白的O-糖基化位點，第5位(N5)的改變可能影響T7正常的O-糖基化，以至影響蛋白的功能。KCNE1在不同物種內的同源性分析表明，N5和N26位兩個糖基化位點保守程度極高，說明糖基化位點在KCNE1內的作用不可替代。本研究加深了N-糖基化在KCNE1中作用的認識，增進了對KCNE1與KCNQ1相互作用的了解，增加了對Iks通道調控的認識，為臨床上預防和治療KCNE1 N-糖基化有關的疾病提供理論依據。

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