非小細胞肺癌組織中PTEN基因與Ki67蛋白的表達及其意義

紀勇，張梓威，陳靜瑜，鄭明峰，吳小波，衛棟

(南京醫科大學附屬無錫市人民醫院心胸外科，江蘇無錫 214023)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率和死亡率呈明顯上升趨勢。磷酸酶-張力蛋白酶(PTEN)基因定位于染色體10q23，是迄今為止人類發現的第一個具有磷酸化酶功能的抑癌基因［1-2］。作為磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/絲-蘇氨酸激酶(AKT)通路的負調控因子，PTEN基因的正常表達可以抑制細胞的惡變以及腫瘤細胞侵襲、轉移、生長，該基因異常突變將導致其抑癌作用缺失，與腫瘤的發生密切相關［3-4］。Ki67是與細胞增殖相關的核抗原，與腫瘤增殖、侵襲性密切相關［5］。本研究通過免疫組化法檢測非小細胞肺癌(NSCLC)組織及其癌旁正常肺組織中PTEN和Ki67蛋白的表達，并結合臨床及病理學特征進行分析，旨在探討二者在NSCLC中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

67例手術標本取自我院2009年6月至2011年5月收治的肺癌患者，并經術后病理診斷證實為NSCLC。其中男33例，女34例，年齡39～80歲，平均(61±4)歲。所有病例按照國際抗癌聯盟(UICC)的診斷標準進行病理分期:Ⅰ期20例，Ⅱ期29例，Ⅲ期18例;鱗癌28例，腺癌3l例，大細胞癌8例;低分化25例，高、中分化42例;有淋巴結轉移者29例，無轉移者38例。同時選取距腫瘤組織＞5 cm的41例正常肺組織作為對照。全部病例術前均無放療和化療。

1.2 試劑與方法

抗體、S-P試劑盒均購自北京中山金橋生物技術有限公司。切除標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，蠟塊以4 μm連續切片，分別進行免疫組化和HE染色。免疫組化采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP法):二甲苯透明，微波抗原修復;0.3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，分別滴加Ki67和PTEN一抗;于4℃冰箱中過夜，依次滴二抗及鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木素復染，分化、脫水、透明封片。用已知的陽性切片作為陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定

PTEN、Ki67在細胞中出現棕黃色細顆粒為陽性細胞。根據染色陽性的細胞數占總細胞數的百分比判斷:陽性率＜5%者為陰性;5%～20%為陽性(+)，＞20%者為強陽性(++)，定義(+)以上為陽性表達。

1.4 統計學處理

采用SPSS 16.0統計學分析軟件包進行統計分析，運用χ2檢驗、Spearman等級相關分析等進行統計學處理，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 NSCLC及癌旁正常肺組織中PTEN和Ki67的表達

PTEN的陽性表達為胞漿內存在不同染色程度的棕黃色顆粒，胞核亦有少量表達。PTEN在癌組織及癌旁正常組織中均有表達，但在癌組織中的失表達率(67.16%)明顯高于正常肺組織(17.07%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。Ki67的陽性染色表現為細胞核著棕黃色，在癌組織中的失表達率(76.12%)亦明顯高于正常組織(7.31%)，差異有統計學意義(P＜0.05)，詳見圖1、表1。

2.2 PTEN和Ki67在NSCLC中的表達與臨床病理特征的相關性

不同性別、年齡組PTEN和Ki67的表達差異無統計學意義(P＞0.05);PTEN和Ki67的表達與組織類型、分化程度及有無淋巴結轉移的相關關系:隨腫瘤分化程度的升高，PTEN表達逐漸升高，而Ki67的表達呈逐漸降低;PTEN陽性表達與淋巴結的轉移率呈負相關，而Ki67蛋白表達與淋巴結轉移率呈正相關，差異有統計學意義(P＜0.05);PTEN和Ki67的表達與腫瘤的位置、大小等無關(P＞0.05)。見表2。

2.3 NSCLC中PTEN表達與Ki67表達的相關性

NSCLC組織中PTEN和Ki67表達水平呈負相關(r= －0.627，P=0.021)，見表3。

3 討 論

圖1 PTEN在非小細胞肺癌(腺、鱗癌)中的陽性表達(A、B)及Ki67在非小細胞肺癌(腺、鱗癌)中的陽性表達(C、D) ×200Fig 1 PTEN(in brown)is expressed in cytoplasm of NSCLC A(adenocarcinoma)，B(squamous carcinoma);Ki67(in brown)is expressed in nuclei of NSCLC C(adenocarcinoma)，D(squamous carcinoma) ×200

表1 PTEN和Ki67在NSCLC及癌旁正常肺組織中的表達例Tab 1 Expression of PTEN and Ki67 in NSCLC and adjacent normal lung tissues case

PTEN是1997年首先被發現的具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，含有1 209個核苷酸，編碼由403個氨基酸組成、相對分子質量為47 000、位于細胞漿的蛋白質，即酪氨酸磷酸酯酶［6］。PTEN編碼的磷酸酯酶通過阻斷PI3K/蛋白激酶B通路，使局灶性黏著斑激酶去磷酸化，下調Ras介導的絲裂酶原激活蛋白激酶活化，進而調控細胞周期，并對細胞增殖、浸潤和遷移等多方面起調控作用［7-9］。Yoshimoto等［10］對前列腺癌的研究顯示，PTEN基因在前列腺癌中的突變率為43%。本研究顯示，PTEN在癌旁正常組織中的缺失或低表達率高于肺癌組織，表明PTEN可能參與了肺癌的發生，其缺失或低表達，可能導致肺組織上皮突變和過度增殖，從而形成腫瘤［11］。肺鱗癌PTEN基因的陽性表達較其他類型低，在不同分化程度的肺癌組織中，PTEN基因的表達同樣有差異。本研究表明，在肺腺癌、鱗癌、大細胞癌組織標本中，分化程度越低，PTEN基因陽性表達率越低，低分化組與高、中分化組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示PTEN基因的缺失與腫瘤的分型和惡性分化程度亦具有相關性。

Ki67是Gerdes等在1983年報告的一種單克隆抗體，是從L428細胞系抽取物免疫小鼠過程中獲得的，其基因位于10號染色體(10q25)上，由分子質量為345 kD和395 kD的兩條多肽鏈組成，其抗原是一種與細胞增殖相關的核蛋白。研究表明，Ki67表達主要位于核內，其功能與染色質相連，可能與細胞有絲分裂和細胞周期相關，能夠反映細胞的增殖活性［12-15］。因此，本研究試圖通過檢測Ki67在肺癌組織中表達，判斷其與腫瘤的惡性生物學特性的相關性。結果顯示:NSCLC與癌旁正常肺組織中均有Ki67增殖抗原表達，Ki67蛋白在NSCLC組織中的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，說明Ki67增殖抗原能間接反映惡性腫瘤的無限增殖活性。本組研究中，淋巴結轉移組Ki67的表達高于無淋巴結轉移組;TNM分期中Ⅲ期的Ki67陽性表達高于Ⅰ、Ⅱ期;低分化組表達高于高分化組。Ki67的表達可能與腫瘤的浸潤轉移、臨床分期和分化程度有關。

表2 PTEN和Ki67在NSCLC中的表達與臨床病理特征之間的相關性 例Tab 2 Correlation of expression of PTEN and Ki67 in NSCLC with clinicopathologic features case

表3 NSCLC中PTEN表達與Ki67表達的關系 例Tab 3 Correlation of the expression of PTEN with Ki67 in NSCLC case

此外，本研究也分析了NSCLC組織中PTEN、Ki67表達的相關性，表明二者的表達存在顯著負相關關系。PTEN表達水平越低、Ki67表達越高，則腫瘤組織細胞增殖越活躍、分化程度越低，患者預后差。因此，聯合檢測PTEN和Ki67對于判斷NSCLC的惡性程度和預后具有一定的臨床意義。

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