經典H-2分子mRNA探針的制備及在C57小鼠中樞神經系統原位雜交中的應用

劉建娥，沈宇清，李明莉，吳曉箐，史茜，張建瓊

(東南大學醫學院病原生物學與免疫學系，發育與疾病相關基因教育部重點實驗室，江蘇南京 210009)

既往認為腦部是免疫豁免區，MHCⅠ類分子僅在病理條件下被誘導表達［1］。但是隨著檢測技術的發展，近年的研究發現，MHCⅠ類分子在正常的未受感染的神經元上也有表達，同時具有時空特異性和可調控性，并發揮了非常重要的作用［2］。但在小鼠中樞神經系統中只在某些時期特定部位發現有MHCⅠ類分子的表達［3-6］，不同發育階段不同部位MHCⅠ類分子的表達模式未見系統性報道。MHC分子具有高度多態性，不同物種之間以及相同物種不同品系之間存在著差異［7］，小鼠 MHC 分子稱為 H-2 復合體［8-9］。H-2復合體是由彼此獨立又緊密連鎖的基因座位組成，長約1 500 kb。H-2復合體基因分為3類，其中Ⅰ類基因因多態性、產物分布與功能的不同又可分為經典與非經典兩類基因。H2-D、H2-K和H2-L為H-2復合體中的經典Ⅰ類基因，在C57小鼠中經典Ⅰ類基因僅包括H2-D和H2-K，并且143～463 bp為其保守序列，此段DNA序列為合成H-2分子特異性mRNA探針提供了依據。

本實驗通過合成地高辛標記的經典H-2 mRNA的特異性探針，利用原位雜交方法觀察經典H-2 mRNA在正常發育的C57小鼠中樞神經系統中的表達情況，為進一步研究經典H-2分子在小鼠中樞神經系統發育中較為精細的表達模式和作用機制及其與非經典Ⅰ、Ⅱ類分子表達的異同奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，質粒小量制備采用QIAGEN公司質粒小量提取試劑盒，轉錄試劑購自Roche公司，PCR擴增試劑購自Invitrogen公司，U47325購自Openbiosystem公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗小鼠與取材 取性成熟的C57BL/6雌雄鼠于16:00后合籠，次日開始每天12:00前檢測雌鼠有無陰道栓，檢出陰道栓的當日標記為E 0.5 d，小鼠出生當日記為P 0。

胚胎鼠腦組織獲得:斷頸處死孕鼠，取出胚胎，在DEPC-PBS中剝除子宮壁和胎膜;將胚胎移入4%DEPC-PFA中，在體視鏡下仔細分離腦組織。將腦組織置于4%DEPC-PFA，4℃過夜固定;用30%蔗糖(0.1 mol·L－1DEPC-PBS配)4 ℃浸泡至組織塊沉底;用OCT包埋，－70℃保存備用。

1.2.2 質粒的構建 根據小鼠經典H-2 cDNA基因序列(U47325)，應用上游引物5'-NNGTN GGCTA YGTKG ACRAC-3'、下 游 引 物 5'-KYRGG TYYTC RTTCA GGG-3'進行PCR產物擴增，目的片段長度為321 bp，對應于小鼠經典H-2核苷酸序列的第143～463位。PCR擴增的條件為:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環30次;72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物(321 bp);PCR純化試劑盒純化PCR產物;通過T4連接酶連接反應，將PCR產物與pGEM-T Easy載體連接。1.2.3 正反義探針的制備 將構建的質粒轉化到DH5α感受態細菌中，經篩選、提取、純化，再根據pGEM-T Easy載體的多克隆位點和經典H-2本身的酶切位點，選用限制性內切酶NcoⅠ和PstⅠ酶切鑒定克隆的質粒。經測序，插入序列的方向與pGEM-T Easy載體自身DNA的方向相同(圖1)。擴增的質粒分別用限制性內切酶NcoⅠ和PstⅠ酶切，使其線性化，再采用T7和Sp6轉錄酶，體外轉錄合成經典H-2 mRNA的正、反義探針。

圖1 pGEM-T Easy載體示意圖(A)、酶切位點(B)及插入序列H-2的位置和方向(C)Fig 1 The sketch map and restriction enzyme cutting site of pGEM-T Easy Vector correspond to A and B.The location and direction of inserted sequence H-2 are shown in C

1.2.4 原位雜交 將在－70℃保存的切片拿到室溫下放置30 min，直至切片回到室溫，再放到50℃雜交爐中烤片烤20 min;DEPC-PBS洗片5 min;4%DEPC的多聚甲醛中前固定20 min，洗片;蛋白酶K緩沖液處理組織切片，洗片;后固定30 min;置于新配制的TEA緩沖液洗10 min;將切片浸在預雜交液中放入63～65℃的雜交爐中預雜交3～4 h;制備濕盒(干的雜交盒底部加用過的預雜交液)，將含0.008 μg·(100 μl)－1探針的雜交液加在切片上;放入65℃的雜交爐中雜交12～16 h;65℃，在預熱的0.2 mol·L－1SSC中洗掉蓋玻片(勿搖);用 PBT洗 2次，每次20 min;10%的血清(PBT稀釋)封閉30 min;倒去切片上的血清，勿洗，加含1∶2 000的抗地高辛抗體的血清，3 h;PBT洗6次，每次10 min;堿性磷酸酶緩沖液洗2次，每次5 min;加顯色液，避光，顯色;PBS終止顯色反應;4%多聚甲醛后固定1～2 h;PBS漂洗，甘油封片劑封片，室溫保存。

2 結 果

2.1 正反義探針的制備

見圖2。

圖2 經典H-2基因片段PCR電泳圖 1、2.PCR擴增的針對經典H-2的特異性片段;3.經典H-2插入pGEM-T Easy載體的目的片段雙酶切鑒定圖;4.Marker DL 2 000Fig 2 The PCR products of classical H-2 gene were examined by standard agarose gel electrophoresis

通過合成引物，PCR擴增出經典H-2的特異性片段，其產物大小為321 bp。圖2中1、2泳道為經典H-2 PCR產物的電泳圖。然后將PCR產物純化后，與pGEM-T Easy載體連接，轉化大腸桿菌DH5α中，提取質粒進行雙酶切鑒定。3泳道為質粒經內切酶NcoⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定圖，可見目的片段大小為321 bp，即為所需片段的大小。

2.2 測序結果

見圖3。

經過測序，目的片段321 bp與經典H-2分子序列(143～463 bp)堿基完全相同，沒有突變，即可運用此菌液克隆擴增，提取質粒線性化進行體外轉錄，采用T7和Sp6轉錄酶，分別合成經典H-2 mRNA的正、反義探針。

2.3 原位雜交

見圖4。

所合成的經典H-2探針運用原位雜交方法鑒定其特異性的可行性。圖4反義探針結果顯示的是經典H-2在C57小鼠P15小腦中的表達情況。同時運用正義探針對相同部位進行雜交，無雜交信號，作為陰性對照。由此可見，合成的經典的H-2 mRNA探針可以特異性地結合組織中的mRNA，可用于原位雜交檢測其在C57小鼠中樞神經系統中的表達模式。

3 討 論

MHC分子在中樞神經系統是否表達曾有爭議，既往沒有在中樞神經系統檢測到MHCⅠ類分子的表達可能是由于以下原因:首先，腦切片組織的固定方法對抗體識別抗原表位的影響，使得抗體的靈敏度下降［10］。其次可能是因為在小鼠不同發育階段有不同的MHCⅠ類分子的表達，所以研究不同發育時期MHCⅠ類分子的表達對抗體的需求不同［3-4］。因而免疫組化方法用于檢測MHCⅠ類分子蛋白水平的表達受到一定的限制，同時蛋白水平和轉錄水平也會出現一定的差異表達。因此選用原位雜交的方法來檢查MHCⅠ類分子在中樞神經系統中的表達也是十分必要的。

MHC是一組緊密連鎖的基因群，經典MHCⅠ類基因區具有高度多態性，這對合成經典Ⅰ類基因的特異性探針提出了很高的要求，所合成的探針必須是針對其堿基序列中的保守片段，這樣才能保證合成的探針是特異的而具有探索價值。在合成正反義探針的時候，所選擇的轉錄片段必須是同一段片段，不能是轉錄的不同的片段，這樣就構不成所謂的正反義探針［11］。

已有證據初步推測MHCⅠ類分子不僅發揮免疫功能，它對正常腦的發育、神經元的分化、突觸可塑性及記憶行為都具有重要的作用［12-14］。MHCⅠ類分子在中樞神經系統的表達及功能的研究是近年的研究熱點，但該高度多態性的分子在小鼠中樞神經系統不同時期的表達模式未見系統性報道，其功能的研究處于起步階段［15-18］。本實驗采用分子生物學技術構建重組質粒合成了地高辛標記的經典H-2 mRNA正、反義原位雜交探針，所得到的反義探針作為雜交檢測探針，而正義探針則作為實驗的陰性對照。通過原位雜交，結果顯示，C57小鼠在P15小腦反義探針呈現陽性結果，即經典H-2 mRNA在P15的小腦有表達，正義探針對相同部位進行雜交則無雜交信號，進一步證實了所合成的經典H-2 mRNA探針的特異性，這為我們研究經典H-2 mRNA在C57小鼠中樞神經系統中的表達譜奠定了基礎。同時運用此方法可以進一步合成非經典H-2Ⅰ類和H-2Ⅱ類基因的特異性探針，比較H-2基因在小鼠中樞神經系統的表達模式差異。

圖3 經典H-2基因片段測序圖——插入的經典H-2 cDNA與C57小鼠經典H-2基因序列測序峰圖Fig 3 The sequence of classical H-2:the inserted sequence of classical H-2 cDNA and the sequence of classical H-2 in C57 mice

本研究結果顯示，我們已經成功構建了特異性的經典H-2 mRNA正、反義探針，為研究H-2分子其他成員在小鼠中樞神經系統中的表達奠定了技術基礎。

圖4 經典H-2在C57小鼠P15小腦的表達 A、B(A圖中黑框的放大).經典H-2反義探針雜交信號;C.經典H-2正義探針雜交信號;Bar:A為450 μm，B、C為150 μm;PK為浦肯野細胞層(Purkinje cell layer);GL為顆粒層(granula layer)Fig 4 Expression of classical H-2 in the cerebellum of P15 in C57 mice

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