免疫性內(nèi)耳病模型的建立及其內(nèi)耳干擾素-γ的表達(dá)

馬熒雪，譚長(zhǎng)強(qiáng)，曹影，王培蓓，陳智斌

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 南京 210029;2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，江蘇南京 210008)

免疫性內(nèi)耳病(immune-mediated inner ear disease，IMIED)是指由內(nèi)耳免疫反應(yīng)造成的內(nèi)耳組織病理?yè)p傷和功能障礙，包括內(nèi)耳局部的免疫炎性疾病和自身免疫性內(nèi)耳疾病。由于其可導(dǎo)致極其嚴(yán)重的、反復(fù)發(fā)作性眩暈、聽(tīng)力障礙等癥狀，目前臨床治療效果亦不甚滿意，給患者的工作乃至生活造成極大的困難和障礙，已有許多耳科學(xué)家們對(duì)其進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察研究，并取得了不少新發(fā)現(xiàn)和成果，但其病因至今尚未完全明確。

干擾素-γ(IFN-γ)是細(xì)胞因子超家族中IFN家族的重要成員，具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，在CD4+細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)中，IFN-γ是由Ⅰ型輔助細(xì)胞T細(xì)胞(Th1細(xì)胞)產(chǎn)生，并被定義為Th1途徑的標(biāo)志性細(xì)胞因子。Solares等［1］研究表明，CD4+T細(xì)胞參與IMIED的發(fā)生發(fā)展，其分化產(chǎn)生的細(xì)胞因子與內(nèi)耳免疫損傷密切相關(guān)。作者以往通過(guò)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)研究證實(shí)IMIED存在T細(xì)胞的參與［2］。Fuse等［3］研究表明，在梅尼埃病相關(guān)的急性低頻感音神經(jīng)性聾患者血清中，Th1細(xì)胞因子IFN-γ水平明顯增高，推斷IFN-γ在IMIED發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。

基于上述各項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)和現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)擬采用鑰孔戚血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyani，KLH)，經(jīng)圓窗龕局部免疫已被KLH致敏的豚鼠，制作IMIED模型，觀察并分析正常豚鼠和IMIED模型豚鼠內(nèi)耳IFN-γ的表達(dá)和變化，為進(jìn)一步的相關(guān)細(xì)胞免疫及臨床研究等提供依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成熟豚鼠，6～8周齡，白毛紅目，雌雄不限，體重250～300 g，耳郭反射正常，耳鏡檢查排除中耳疾患。所用動(dòng)物由南京市青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2007-0008］。

1.2 抗原

KLH為一種深海軟體動(dòng)物體內(nèi)提取的純化蛋白，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及模型制作

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 20只豚鼠按配對(duì)設(shè)計(jì)方法，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物采用KLH免疫(包括全身致敏和圓窗龕局部免疫)，對(duì)照組用PBS代替KLH免疫。

1.3.2 免疫方法［4］首次免疫采用500 μg KLH 溶解于 250 μl PBS(0.01 mol·L－1，pH 7.4)中，與等量完全弗氏佐劑混勻、乳化，于豚鼠右后足墊注射。首次免疫 2 周后，采用 500 μg KLH 溶解于 250 μl PBS(0.01 mol·L－1，pH 7.4)中，與等量不完全弗氏佐劑混勻、乳化，于豚鼠背部多點(diǎn)皮下注射加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫2周后，采用KLH溶液在已致敏豚鼠圓窗龕局部免疫，具體操作方法:1%的戊巴比妥鈉(30 mg·kg－1)腹腔注射麻醉豚鼠，在右側(cè)耳郭后上方備皮、消毒后，做一1.5～2.0 cm弧形切口，分離并暴露聽(tīng)泡，用電鉆在聽(tīng)泡上鉆一直徑約0.5 cm的圓孔，顯露圓窗龕。在手術(shù)顯微鏡下將一小片吸附5 mg·ml－1KLH(PBS稀釋)的明膠海綿放置于圓窗龕局部，在中耳腔中滴抗生素(0.3%氧氟沙星滴耳液約0.2 ml)后縫合切口，全部過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。對(duì)照組動(dòng)物用PBS代替KLH免疫，方法相同。

1.3.3 模型判斷標(biāo)準(zhǔn) 圓窗龕局部免疫2周后，豚鼠血清中KLH特異性抗體水平升高(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)即ELISA法檢測(cè)，波長(zhǎng)490 nm A值超過(guò)免疫前全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差)和聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位Ⅲ波的閾值升高(即Ⅲ波閾值超過(guò)免疫前全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差)，判斷為IMIED動(dòng)物模型制作成功。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 特異性免疫反應(yīng)測(cè)試 采用ELISA法測(cè)定血清中特異性抗KLH抗體水平。2次測(cè)試分別于免疫前和圓窗龕局部免疫后2周進(jìn)行。心臟采血，分離血清，用 100 μg·ml－1的 KLH 溶液包被 96 孔酶聯(lián)板，于4℃過(guò)夜并封閉，加入1∶10稀釋的豚鼠血清，37℃孵育2 h，洗板5次，加入1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A(horse radish peroxidase marked staphylococal protein A，HRP-SPA)，37 ℃下孵育1 h，洗板5 次，加入3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，顯色10 min后用H2SO4終止顯色，在酶標(biāo)儀下測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm的A值。

1.4.2 聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位測(cè)試 分別于免疫前和末次免疫后2周進(jìn)行，采用聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位測(cè)試系統(tǒng)，豚鼠頭頂冠狀縫與矢狀縫交界處插入針形電極作為測(cè)試電極，參考電極置于耳郭后方靠近乳突尖部，接地電極置于對(duì)測(cè)乳突尖部，刺激聲信號(hào)采用Click，重復(fù)頻率為11次·s－1，疊加1 024次，記錄時(shí)程10 ms，測(cè)定Ⅲ波的閾值。

1.4.3 石蠟切片制作、HE染色和光鏡觀察 末次聽(tīng)覺(jué)測(cè)試后，選取實(shí)驗(yàn)組造模成功動(dòng)物(7只，12耳)及對(duì)照組所有動(dòng)物內(nèi)耳制作石蠟切片。具體方法:動(dòng)物麻醉后斷頭，立即取出顳骨，打開(kāi)聽(tīng)泡，放置于4%多聚甲醛固定液中，12 h后換EDTA脫鈣7～10 d，修剪后流水沖洗1～2 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、定向包埋。耳蝸中軸切片，片厚5 μm，漂片、撈片、粘片，常規(guī)HE染色，封片，置于光鏡下觀察內(nèi)耳結(jié)構(gòu)病變。

1.4.4 酶免疫組化試驗(yàn) 末次聽(tīng)覺(jué)測(cè)試后，選取實(shí)驗(yàn)組造模成功動(dòng)物(7只，12耳)及對(duì)照組所有動(dòng)物，麻醉后斷頭，立即取出顳骨，石蠟切片制作方法同上述。用胰酶(0.2%)修復(fù)抗原，正常山羊血清封閉10 min，加PBS稀釋的一抗，即大鼠抗小鼠IFN-γ單克隆抗體，4℃過(guò)夜，PBS洗5 min 3次，加入HRP標(biāo)記的兔抗大鼠IgG單克隆抗體作為二抗，37℃孵育30 min，PBS洗5 min 3次，DAB染色，封片，光學(xué)顯微鏡觀察攝片。以上試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，各組血清中KLH的特異性抗體水平(A值)、ABRⅢ波閾值的結(jié)果符合正態(tài)分布，所得數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(配對(duì)t檢驗(yàn))，P＜0.05判斷為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 特異性免疫反應(yīng)測(cè)試結(jié)果

見(jiàn)表1。

表1 免疫前后兩組血清特異性KLH抗體水平(A值±s)Tab 1 Specific antibody capability of KLH from the blood serum of each group before and after the immunization(A value，x±s)

表1 免疫前后兩組血清特異性KLH抗體水平(A值±s)Tab 1 Specific antibody capability of KLH from the blood serum of each group before and after the immunization(A value，x±s)

a與免疫前比較，P＜0.05

組 別A 值免疫前 免疫后實(shí)驗(yàn)組 0.544±0.111 0.817±0.129a對(duì)照組 0.537±0.111 0.526±0.124 P值 ＞0.05 ＜0.05

兩組比較，免疫前血清中KLH抗體平均水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，免疫后則差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組內(nèi)免疫前后比較，實(shí)驗(yàn)組免疫后血清KLH抗體水平明顯增高(P＜0.05)，對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位測(cè)試結(jié)果

見(jiàn)表2和圖1。

表2 免疫前后各組ABRⅢ波閾值測(cè)試結(jié)果(x±s)dB，SPLTab 2 Result of threshold of ABRⅢwave from each group before and after the immunization(x±s)dB，SPL

免疫前所有動(dòng)物ABRⅢ波的閾值:x=30.38，s=5.36，x+2s=41.10 dB。對(duì)照組動(dòng)物在免疫后ABRⅢ波的閾值均小于41.10 dB，免疫前后ABRⅢ波的閾值均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫后實(shí)驗(yàn)組ABR聽(tīng)閾值大于41.10 dB動(dòng)物有7只12耳。ABRⅢ波的閾值均值兩組間比較，免疫前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，免疫后則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組內(nèi)免疫前后比較，實(shí)驗(yàn)組免疫后ABRⅢ波的閾值均值明顯增高(P＜0.05)，對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 免疫后ABR測(cè)試結(jié)果 A.對(duì)照組1只動(dòng)物Ⅲ波正常顯示，隨刺激聲強(qiáng)遞減，潛伏期逐漸延長(zhǎng);B.實(shí)驗(yàn)組1只動(dòng)物最大聲強(qiáng)輸出(90 dB，SPL)未誘導(dǎo)出明顯的ABR波型Fig 1 The result of ABR test A.Ⅲ wave of one animal in the control group was normal，and the delitescence increasingly delayed with the stimulation sound intensity decreasing;B.ABR wave of one animal was not induced with the highest sound intensity output(90 dB，SPL)in experimental group

2.3 內(nèi)耳光鏡觀察結(jié)果

見(jiàn)圖2、3。免疫后實(shí)驗(yàn)組造模成功動(dòng)物內(nèi)耳均出現(xiàn)較為顯著的炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)包括Rosenthal's管中和螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞(單個(gè)核細(xì)胞為主)浸潤(rùn)，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性(主要表現(xiàn)為胞體腫脹)和部分耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)減少，蝸管及鼓階或前庭階可見(jiàn)絮狀物;部分豚鼠出現(xiàn)不同程度迷路積水;Corti器及毛細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯異常。對(duì)照組動(dòng)物內(nèi)耳結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常。

2.4 酶免疫組化試驗(yàn)

對(duì)照組內(nèi)耳幾乎沒(méi)有IFN-γ陽(yáng)性免疫反應(yīng);實(shí)驗(yàn)組造模成功耳觀察到明顯的IFN-γ陽(yáng)性免疫反應(yīng)，主要分布在血管紋、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器及蝸軸小血管周圍。見(jiàn)圖4。

3 討 論

1979年McCabe［4］經(jīng)臨床觀察研究首先提出了自身免疫性感音神經(jīng)性聾(autoimmune sensorineural hearing loss，ASNHL)的概念。此后，一類由免疫介導(dǎo)的內(nèi)耳損害所致的疾病或癥狀群陸續(xù)被報(bào)道，統(tǒng)稱為IMIED。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察研究表明，內(nèi)耳并非免疫豁免部位，它具有不同于一般的免疫機(jī)制，呈一獨(dú)立的免疫狀態(tài)，內(nèi)淋巴囊是內(nèi)耳免疫反應(yīng)的主要部位。由于不可能直接在人體上獲取標(biāo)本進(jìn)行觀察研究，因此通過(guò)免疫動(dòng)物建立模型是目前研究IMIED的主要方法。用于建立內(nèi)耳病模型的抗原主要有Ⅱ型膠原、Ⅸ型膠原、P0蛋白、熱休克蛋白70、同種純化內(nèi)耳抗原、β-微管蛋白、KLH等。本實(shí)驗(yàn)采用KLH免疫豚鼠建立IMIED動(dòng)物模型。

圖2 兩組螺旋神經(jīng)節(jié)的光鏡觀察結(jié)果 A.對(duì)照組，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)正常 HE 40×10;B.實(shí)驗(yàn)組，部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腫脹或數(shù)量減少 HE 40×10Fig 2 Result of light microscopic A.Showed the spiral ganglion of the control group，the number and morphology of the ganglion cell were normal HE staining 40×10;B.Showed the spiral ganglion of the experimental group ，the number and morphology of the ganglion were normal HE staining 40×10

圖3 兩組蝸管橫切面的光鏡觀察結(jié)果 A.對(duì)照組，Corti器和前庭膜位置、形態(tài)基本正常 HE 40×10;B.實(shí)驗(yàn)組，Corti器形態(tài)基本正常，但前庭膜呈現(xiàn)隆起狀 HE 40×10Fig 3 Result of light microscopic exzamination A.Showed the transverse section of the cochlear duct of the control group ，the position and the morphology of the vestibular membrane and the organ of Corti were normal HE staining 40 ×10;B.Showed the transverse section of the cochlear duct of the experimental group，the morphology of the organ of Corti was normal，however，the vestibular membrane was found eminence HE staining 40×10

KLH提取于軟體動(dòng)物，是一種很強(qiáng)的細(xì)胞依賴性大分子抗原，被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。Woolf和Ma等［5-6］將KLH直接注入已被KLH系統(tǒng)致敏的動(dòng)物內(nèi)耳，造成較為嚴(yán)重的聽(tīng)力損失，且聽(tīng)力損傷的發(fā)生率非常高，即成功建立了免疫性感音神經(jīng)性聾動(dòng)物模型。但由于該法可能會(huì)直接破壞內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，且這種模型產(chǎn)生的聽(tīng)力損失也很難治療。鄒靜等［7］用KLH在圓窗豚鼠部位免疫，用MRI在活體內(nèi)觀測(cè)到KLH免疫誘導(dǎo)的膜迷路積水，并同時(shí)檢測(cè)到聽(tīng)力損失的存在。本實(shí)驗(yàn)采用KLH全身致敏豚鼠后，再在圓窗龕局部免疫，經(jīng)特異性免疫試驗(yàn)和聽(tīng)覺(jué)功能測(cè)定，成功地建立了免疫性感音神經(jīng)性聾動(dòng)物模型，而且造模成功率高達(dá)約60%。ELISA法測(cè)定顯示免疫后實(shí)驗(yàn)組豚鼠血清中特異性KLH抗體水平較免疫前明顯增高。內(nèi)耳切片觀察顯示，模型動(dòng)物內(nèi)耳蝸管內(nèi)有絮狀物，蝸軸等部位有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分動(dòng)物出現(xiàn)不同程度膜迷路積水等。

圖4 兩組免疫組化結(jié)果 A.對(duì)照組，未見(jiàn)明顯IFN-γ表達(dá) 40×10;B.實(shí)驗(yàn)組，可見(jiàn)螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器、血管紋、血管內(nèi)皮等部位有明顯IFN-γ表達(dá) 40×10Fig 4 Result of immunohistochemical test A.No IFN-γ expression was detected in the inner ears of the control group 40 ×10;B.The IFN-γ expression was detected in the inner ears of the experimental group as following sections:organ of Corti，spiral ligament，stria vasculais 40×10

目前，根據(jù)細(xì)胞因子分泌模式，CD4+T細(xì)胞可分為Th1和 Th2細(xì)胞亞群:Th1主要分泌 IL-2、IFN-γ、TNF-α和TNF-β，統(tǒng)稱為Th1型細(xì)胞因子;Th2主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-13，統(tǒng)稱為 Th2型細(xì)胞因子［8］。Th1主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和巨噬細(xì)胞活化以及遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH);Th2主要介導(dǎo)體液免疫、B細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞活化以及IgE的生成。IFN-γ能抑制Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生，并能上調(diào)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的黏附分子［9］。在很多自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、萊姆病(lyme disease，LD)、多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)等中存在Th1和Th2細(xì)胞因子的不平衡。Pawankar等［10］研究表明，IFN-γ在免疫介導(dǎo)的內(nèi)耳病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目前期試驗(yàn)中，采用IL-10［11-12］、IL-4［13］等 Th2細(xì)胞因子基因?qū)?IMIED動(dòng)物模型內(nèi)耳的方法，提高Th2細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)，發(fā)現(xiàn)對(duì)IMIED動(dòng)物模型聽(tīng)力損失的改善有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即治療有效。推測(cè)在IMIED發(fā)生發(fā)展中TH1免疫途徑可能占優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型內(nèi)耳切片ELISA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)，Corti器、蝸軸小血管內(nèi)皮及其周圍等部位有明顯的Th1細(xì)胞因子IFN-γ陽(yáng)性反應(yīng)，而在對(duì)照組的內(nèi)耳切片中幾乎沒(méi)有IFN-γ免疫反應(yīng)，從而提示:正常狀態(tài)下，內(nèi)耳幾乎或極少存在Th1細(xì)胞因子IFN-γ，在免疫誘導(dǎo)下，其含量顯著增多，在IMIED的發(fā)生中可能起著重要作用，即IMIED發(fā)病機(jī)制中Th1途徑占優(yōu)勢(shì)。具體的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究和觀察。目前對(duì)IMIED主要是由細(xì)胞免疫還是體液免疫起主要作用、亦或兩者均起作用、或在不同病理情況下兩者的作用機(jī)制尚無(wú)定論。本項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞免疫機(jī)制在IMIED的發(fā)生中肯定起著重要作用。所以我們的結(jié)論是:KLH經(jīng)圓窗誘導(dǎo)的IMIED模型的成功率較高;正常豚鼠內(nèi)耳中幾乎沒(méi)有IFN-γ表達(dá)，IMIED豚鼠內(nèi)耳中IFN-γ的表達(dá)顯著，提示IMIED的發(fā)生可能與IFN-γ表達(dá)有關(guān)。

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