均勻設計實驗優選白毛夏枯草中總黃酮的提取工藝

涂愛國，徐國蓮

（江西中醫藥高等?？茖W校，江西 撫州 344000）

現代研究表明，黃酮類化合物有明顯的抗氧化、抗炎、抑菌、抗癌及降血脂等生物活性，已廣泛應用于食品和醫藥行業[1]。白毛夏枯草為唇形科植物筋骨草屬金瘡小草（Ajuga decumbens T hunb.）的全草，主要分布在秦嶺以南各省區。白毛夏枯草性味苦寒，民間主要用于止咳化痰、清熱、涼血、消腫、解毒，治療腹瀉、肝炎、疔毒癤腫、外傷出血等[2]?，F代藥理研究證明，白毛夏枯草具有保肝利膽、鎮咳、祛痰、平喘等作用[3]，其主要有效成分為黃酮。本實驗采用均勻設計法安排實驗，優選出合理的總黃酮提取工藝，為生產工藝參數的選擇提供實驗數據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DK-98-I電子恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），十萬分之一天平（北京賽多利斯天平有限公司），TU-1901雙波長紫外可見分光光度計（北京普析儀器有限公司），JJ200型電子天平（常熟市雙杰測試儀器公司），KQ-100型超聲儀（昆山市超聲波儀器廠）。

1.2 試藥

蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所）；化學試劑均為分析純；白毛夏枯草藥材于2008年7月采購自樟樹藥材市場，經江西中醫藥高等專科學校李秀英副教授鑒定為唇形科植物筋骨草屬金瘡小草（Ajuga decumbens T hunb.）。

2 方法與結果

2.1 白毛夏枯草總黃酮含量的測定

2.1.1 供試品溶液的制備 精確稱取過40目篩的白毛夏枯草藥材3份，每份10g，加100mL乙醇，采用熱回流法提取。每份平行提取兩次，過濾，合并濾液并定容至250mL容量瓶中，即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精確稱取在110℃干燥至恒重的蘆丁對照品12mg，置于50mL容量瓶中，加適量甲醇使其溶解后，加甲醇至刻度，搖勻，精確吸取20mL置于50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.3 測定波長的選擇 精確吸取對照品溶液3mL和供試品溶液0.2mL分別置于25mL刻度試管中，各加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉溶液10mL，加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應試劑為空白溶液，分別在400～700nm波長范圍內進行掃描。結果：對照品和供試品溶液在510nm處有最大吸收，且光譜形狀極為相似，形成的絡合物在常溫下穩定性好，滿足分光光度法測定的基本要求。因此，選定510nm作為測定波長。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分別置于25mL刻度試管中，各加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉溶液10mL，加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應試劑為空白溶液，以紫外-可見分光光度法在510nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。得到回歸方程為：A=11.48C+0.053，R=0.998，對照品蘆丁的濃度在0.0052～0.0386mg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系。

2.1.5 精密度實驗 精密量取同一供試品溶液0.5mL，按2.1.3項操作，平行測定5次，相對標準偏差（RSD）為1.1%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 重復性實驗 取同一供試品溶液5份，每份精密量取0.5mL，按2.1.3項操作，測定，RSD為1.5%，表明該方法重現性良好。

2.1.7 穩定性實驗 在室溫條件下，精密吸取同一供試品溶液，在0小時、2小時、4小時、6小時、8小時內分別測定A值，分別為0.589、0.599、0.594、0.596、0.590，計算其 RSD為 0.3%，說明供試品溶液在8小時內穩定。

2.1.8 回收率實驗 精密吸取已知總黃酮含量的同一供試品溶液0.5mL，取5份，分別精密加入對照品溶液適量，按2.1.3項操作測定吸光度，得出總黃酮含量，計算出加樣回收率。結果，平均回收率為94.2%，RSD為1.6%，表明該法回收率良好。

2.2 均勻設計實驗

均勻設計法由方開泰研究員和數學家王元在1978年共同提出，它是將數學論和多元統計相結合的一種新穎的實驗方法，其核心思想是用確定性方法尋找空間中均勻分布的點集來代替Monte carlo中的隨機數，它通過提高實驗點“均勻分散”的程度，使實驗點具有更好的代表性及能用較少的實驗獲得較多的信息。

2.2.1 因素水平及指標的確定 采用乙醇回流提取白毛夏枯草總黃酮，主要影響因素為乙醇濃度（%）、料液比、提取時間（h）3個因素，故以此三因素為參考水平，共設9個水平進行均勻設計實驗，優選最佳提取條件。用U9（93）均勻設計表安排實驗，以總黃酮含量為評價指標。因素水平見表1。

2.2.2 實驗安排及結果 按2.1.1項方法制備供試品溶液，分別精密吸取1～9號各0.5mL，按2.1.3項操作。測定其在510nm處吸光度A。由回歸方程計算出總黃酮含量，并進行方差分析。均勻設計實驗安排及結果見表2，方差分析結果見表3。

將表3數據輸入計算機，通過王玉方“均勻設計”3.00軟件進行數據處理，采用逐步回歸（后退法）進行多元線性回歸處理，得多個多元回歸方程，最后優選確定回歸方程為Y=-0.924+0.0267A+0.0527B+0.0941C。由表 3可知，F=10.86，P<0.05，回歸方程在α=0.05水平上有顯著意義，通過計算方程中各項對回歸的貢獻:C>B>A。依據回歸方程和實際經驗，選擇白毛夏枯草中總黃酮的提取工藝為料液比1∶25，乙醇濃度80%，提取時間兩小時，總黃酮含量預期值為4.86%。

2.2.3 驗證實驗 根據優化工藝進行總黃酮的提取，制備3批樣品，測定其中總黃酮含量，見表4。得平均值Y=4.69%，與理論推測值相近，在其范圍區間內。

3 討論

均勻設計法在條件范圍變化大而需要進行多水平實驗的情況下，可極大地減少實驗的次數，它只需要與因素水平數相等次數的q次實驗即可獲得正交設計的至少做q2次實驗所能獲得的實驗結果。均勻設計只考慮實驗點在實驗范圍內充分“均勻散點”，而不考慮“整齊可比”，因此實驗的結果沒有正交實驗結果的整齊可比性，其實驗結果的處理多采用回歸分析方法。均勻設計實驗不僅能找到最優的實驗條件組合，還能建立可定量描述指標和因素間關系的數學模型[4]。

通過均勻設計實驗結果分析，確定提取次數為影響白毛夏枯草總黃酮提取率的主要因素，影響顯著;而溶劑用量和乙醇濃度對白毛夏枯草總黃酮提取率的影響很小，不顯著。最后確定最佳提取工藝為料液比1∶25，乙醇濃度80%，提取時間2小時。均勻設計實驗驗證結果與預測結果基本接近，表明該提取工藝穩定、可行。

表1 因素水平

表2 均勻設計實驗安排及結果

表3 方差分析

表4 驗證實驗結果（n=3）

[1]許瑞波，曹曉英，王明艷.睡蓮葉黃酮的提取及其抑菌活性研究[J].食品科技，2009，34（4）：190-197.

[2]南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].2版.上?！蒙虾？茖W技術出版社，2006.

[3]馬志平，黃榕.筋骨草有效部位黃酮類粗品的保肝試驗[J].海峽藥學，2002，14（5）：40-41.

[4]方開泰.均勻設計——數論方法在試驗設計的應用[J].應用數學學報，1980，3（4）：363.