復方氟尿嘧啶注射液包封率的測定方法研究

張迪，姜梅，郭宏偉，李沫，李尚穎，孫苓苓#（.遼寧省食品藥品檢驗所，沈陽003；.沈陽市藥品檢驗所，沈陽 000）

脂質體作為藥物載體具有使藥物帶有靶向性、降低藥物毒性、提高藥物穩定性等特點[1]，而其包封率是評價這類制劑質量的重要指標。常用的脂質體與游離藥物的分離方法有：葡聚糖凝膠過濾法[2-3]、超速離心法[4]、超濾膜過濾法、超濾離心法等，而本文的研究對象來自某企業研制的復方氟尿嘧啶注射液為一種多相脂質體，準確測定其包封率有一定的困難。為建立其科學、合理的包封率測定方法，筆者試驗了超濾離心法測定該制劑的包封率，同時進行了方法學研究。結果表明，建立的方法操作簡單，結果準確、重復性好。

1 材料

1.1 儀器

2010型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津公司）；CP225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；高速低溫離心機（日本日立公司）。

1.2 藥品與試劑

復方氟尿嘧啶注射液（A企業，小試樣品，批號：20100601、20100602、20100603，規格：10ml∶40mg）；氟尿嘧啶對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100187-200602，純度：100.0%）；甲醇為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[5]

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（200mm×4.6mm，5μm）；以水（0.05mol/L磷酸溶液調節pH 值至3.5）-甲醇（95∶5）為流動相，流速為1.0ml/min；紫外檢測波長為265nm；柱溫為35℃；進樣量為10μl。

2.2 線性關系考察

精密稱取氟尿嘧啶對照品9.73mg，置于25ml量瓶中，加甲醇15ml使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取0.1、0.2、0.5、1、2、5ml，分別置于10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取10μl注入色譜儀，記錄峰面積。以氟尿嘧啶峰面積（y）為縱坐標、質量濃度（x）為橫坐標進行線性回歸，得y＝3×106x+33186（r＝0.9999，n＝6）。結果表明，氟尿嘧啶檢測質量濃度線性范圍為3.892～194.6μg/ml。

2.3 精密度試驗

取同一對照品溶液進樣，每次10μl，連續進樣6次，測定氟尿嘧啶峰面積RSD＝0.1%。

2.4 專屬性試驗

按處方取相當于10ml注射液的其他原輔料（除氟尿嘧啶外），置于100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過。取續濾液，進樣測定。結果表明，其他原輔料對氟尿嘧啶的測定無干擾，色譜見圖1A。

圖1 高效液相色譜圖A.輔料；B.供試品；C.對照品；1.氟尿嘧啶Fig 1 HPLC chromatogramsA.recipients；B.test sample；C.substance control；1.fluorouracil

2.5 對空白脂質體透過能力的考察

取空白脂質體適量，分別置于100kD和3kD截留分子質量的超濾離心管中，10000r/min離心30min，采用HPLC-蒸發光散射（ELSD）法測定續濾液中磷脂酰膽堿的含量[6]。結果表明，濾液中均未檢測到磷脂酰膽堿，說明2種超濾離心管均可以完全截留脂質體，且離心方法不會破壞脂質體。

2.6 游離藥物的回收率

精密量取空白脂質體（A企業提供，取除氟尿嘧啶外的原輔料，照生產工藝同法制備）10ml，置于具塞試管中，加入相當于處方量50%、100%和150%的氟尿嘧啶對照品各3份，精密稱定，反復翻轉至氟尿嘧啶全部溶解。用100kD截留分子質量的超濾離心管，10000r/min離心30min。各精密量取續濾液1ml，置于100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取濾液10μl注入色譜儀，記錄色譜圖，以外標法計算回收率。結果表明，超濾離心管對樣品無吸附，回收率符合規定，詳見表1。

2.7 截留分子質量的選擇

取“2.6”項下試驗樣品，另采用3kD截留分子質量的超濾離心管，同法操作，計算回收率。結果表明，3kD截留分子質量的超濾離心管也對測定結果無影響，詳見表1。說明2種超濾離心管均可。本方法選用100kD的超濾離心管。

2.8 重復性試驗

精密量取本品1ml，共6份，用100kD截留分子質量的超濾離心管，10000r/min離心30min。精密量取濾液1ml，置于100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取10μl注入色譜儀，記錄色譜圖，結果峰面積的RSD＝0.8%。表明本方法重復性良好。

2.9 藥物總量的測定[7]

精密量取本品1ml，置于100ml量瓶中，加甲醇10ml使溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻。經0.45μm濾膜濾過后取續濾液10μl注入色譜儀，記錄色譜圖。

2.10 包封率測定方法

取本品，用100kD截留分子質量的超濾離心管，10000r/min離心30min；精密量取濾液1ml，置于100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。取10μl注入色譜儀，記錄色譜圖，得峰面積為A；同時精密量取本品1ml，照“2.9”項下方法進樣測定，得峰面積為B，按公式[（B－A）/B×100%]計算包封率。

表1 2種超濾離心管條件下的回收試驗結果（n＝9）Tal 1 Results of recovery tests by 2kinds of ultrafiltration centrifuge tube（n＝9）

2.11 2種方法包封率的測定

（1）按照“2.10”項下方法，取復方氟尿嘧啶注射液適量，測定包封率。結果，3批樣品包封率分別為9.1%、8.8%和8.7%，對照品及供試品色譜圖見圖1B、C。

（2）采用原標準方法[8]，精密量取本品10ml，采用超速低溫離心法[18000r/min，溫度（10±2）℃]離心15min，吸取脂質體層，置于10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取1ml，置于50ml量瓶中，用甲醇-水（1∶5）溶液稀釋至刻度，搖勻，照HPLC法[2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅤD][5]試驗。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-水-三乙胺（16∶84∶0.2）為流動相，用80%磷酸溶液調節pH值至4.0，檢測波長為266nm。取10μl注入色譜儀，記錄色譜圖，得峰面積為A′；同時精密量取本品1ml，置于50ml量瓶中，按上述方法自“用甲醇-水（1∶5）的溶液稀釋至刻度”起，同法操作，得峰面積為B′，按公式（A′/B′×100%）計算[8]包封率分別為30.8%、31.6%和28.3%。

3 討論

由于氟尿嘧啶為親水性物質，在生產及貯存過程中易發生滲漏現象。該品種的含量測定結果[7]符合質量要求，但包封率均不高，而采用本方法測定其包封率也僅約為10%。

原標準[8]采用超速低溫離心法，經試驗，采用該方法無法將本品的外水相和脂質體完全分離，上清液不澄清；且離心后脂質體間易包裹部分外水相，導致測定的結果偏高（約30%），無法準確地反映產品質量。如果選用葡聚糖凝膠過濾法，脂質體在分子篩間篩選的過程中容易破裂，致使已包裹在脂質體中的藥物溢出至外水相，導致包封率測定結果偏低，甚至是零。故最終選定超濾離心法作為測定方法。

超濾離心法是以壓差為動力的膜分離技術，利用特定截留分子質量的濾膜使游離藥物被過濾而脂質體被截留，從而使脂質體與游離藥物分離。通過對空白脂質體透過能力的考察，結果表明該方法可完全截留脂質體，且不會破壞脂質體，保證了測定結果的可靠性。游離藥物的回收率試驗結果表明，該方法不會對游離藥物造成吸附，可準確測定游離藥物的含量。

綜上所述，本文建立的方法可方便、準確地測定復方氟尿嘧啶注射液的包封率。

[1] 崔福德.藥劑學[M].1版.北京：中國醫藥科技出版社，2002：495-496.

[2] 吳駿，朱家壁.阿昔洛韋脂質體包封率的測定[J].藥物分析雜志，2003，23（3）：213.

[3] 高曉黎，季興梅.葡聚糖凝膠色譜柱法測定脂質體包封率的條件篩選[J].中國藥學雜志，2003，38（7）：515.

[4] 徐斌，趙晶.川穹嗪聚乳酸納米粒的包封率測定[J].南京中醫藥大學學報，2011，27（1）：77.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：540-541、附錄ⅤD.

[6] 張迪，楊錯，孫寬，等.HPLC-ELSD法測定復方氟尿嘧啶注射液中磷脂酰膽堿的含量[J].中國藥事，2012，26（9）：974.

[7] 張迪，郭宏偉，孫寬，等.HPLC法測定復方氟尿嘧啶注射液含量及有關物質[J].中國藥師，2012，15（3）：356.

[8] 國家藥典委員會.國家藥品標準：化學藥品地方標準上升國家標準：第七冊[S].北京：人民衛生出版社，2002：138-139.