Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化多西他賽微乳注射液制備工藝

果秋婷，張小飛（1.咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，陜西咸陽712000；2.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院陜西省中藥制藥重點學(xué)科，陜西咸陽 712046）

多西他賽（Docetaxel）為紫杉醇類抗腫瘤藥，是由賽諾菲-安萬特公司在1995開發(fā)上市的一種紫杉醇烷類抗癌藥，商品名：Taxotere?（泰素帝?）。其作用機制是通過干擾細胞有絲分裂和分裂間期細胞功能所必需的微管網(wǎng)絡(luò)而起到抗腫瘤作用。臨床上用于治療乳腺癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、頭頸癌、胃癌以及前列腺癌等多種腫瘤的治療。由于多西他賽在水中的溶解度極低（約10mg/L），因此在制劑中加入了大量的聚山梨酯80（每支540mg）作為增溶劑來增加藥物溶解性。然而聚山梨酯80在注射進入體內(nèi)后，機體會產(chǎn)生明顯的過敏反應(yīng)[1]，因此開發(fā)一種不含聚山梨酯80的多西他賽注射劑一直是研究的熱點[2-3]。

微乳（Microemulsion）是一種較為穩(wěn)定的O/W型乳劑，其粒徑一般在0.1～1μm范圍內(nèi)，主要是以植物油（脂肪酸甘油三酯）為油相，以磷脂為乳化劑，可供靜脈注射用，能完全被機體代謝利用，因此又被稱為靜脈注射用脂肪乳劑（Intravenous lipid/fat emulsion）。近年來，微乳制劑作為藥物傳遞系統(tǒng)在制藥領(lǐng)域也正發(fā)揮著越來越重要的作用[4]。本研究將多西他賽制備成微乳注射液，并通過Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化其制備工藝，旨在為多西他賽注射給藥系統(tǒng)的開發(fā)與應(yīng)用提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

高壓均質(zhì)機（加拿大ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司）；高速剪切機（德國IKA集團公司）；Agilent-1200高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent科技有限公司）；Mastersizer 2000粒度分析儀、Zetasizer Nano電位分析儀（英國馬爾文儀器公司）；JM21200EX透射電鏡（日本電子公司）；GC2120GX日立低溫離心機（日本日立公司）。

1.2 藥品與試劑

多西他賽對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100666-201201，純度：≥99.7%）；多西他賽原料藥（江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，批號：120122-1，純度：≥99.5%）；蛋黃卵磷脂（德國Lipoid公司，批號：1032881）；大豆油（鐵嶺北亞藥用油有限公司，批號：11020103-2-01）；注射用甘油（浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司，批號：100801，規(guī)格：每瓶500ml）；油酸（德國Lipoid公司，批號：202640，純度：≥99.0%）；無水乙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：0214-2012）；氫氧化鈉（批號：20110203）、鹽酸（批號：20120122）均來源于湖南爾康制藥有限公司；注射用水為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

根據(jù)第35版《美國藥典》中的多西他賽注射液含量測定方法操作。色譜柱：Kromasil C18（200mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.043mol/L醋酸銨溶液-乙腈（45∶55），流速：1.0ml/min；檢測波長：232nm；柱溫：25℃；進樣量：20μl。稱取多西他賽對照品約12.0mg，精密稱定，置于同一個100ml量瓶中，加少量甲醇溶解后，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。在此色譜條件下，精密量取對照品貯備液適量，定量稀釋成含多西他賽0.6、1.2、6.0、12.0、24.0、48.0mg/L的溶液，以多西他賽峰面積（A）對其質(zhì)量濃度（c）進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A＝40894c+3364.1（r＝0.9999），表明多西他賽檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.6～48.0mg/L。專屬性試驗考察結(jié)果表明，在此色譜條件下，輔料對多西他賽的測定無干擾，理論板數(shù)為6000，分離度＞1.5，拖尾因子均在0.95～1.05；高、中、低水平的平均回收率為100.2%，RSD＝0.8%（n＝3）；日內(nèi)精密度RSD＝0.9%（n＝3），日間精密度RSD＝1.1%（n＝3）。

2.2 微乳的制備

2.2.1 處方確定。根據(jù)微乳的經(jīng)典處方[5]和預(yù)試驗結(jié)果，本品的處方初步篩選結(jié)果見表1。

表1 處方初步篩選結(jié)果Tab 1 Results of initial screening of the formulations

2.2.2 制備工藝。水相制備：將處方量甘油、油酸加至80%注射用水中，置于磁力攪拌器中加熱至65℃，攪拌溶解，即得。油相制備：將處方量油相加熱至65℃；將處方量的多西他賽和蛋黃卵磷脂溶于適量無水乙醇中；將油相與多西他賽乙醇溶液混合，65℃保溫，氮氣流下?lián)]干乙醇，得到澄清的含藥油相。微乳制備：在高速剪切機攪拌下（20000r/min），將油相加入至水相中，持續(xù)高速剪切10min，制得初乳。將制備好的初乳轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機中，控制制備溫度，以一定的壓力進行均質(zhì)，并循環(huán)均質(zhì)多次，即制備成多西他賽微乳。將微乳pH值調(diào)至6.0左右，用注射用水定容至全量。分裝，沖氮氣，封口，121℃旋轉(zhuǎn)水浴滅菌10min，冷水浴迅速降溫，即得。

2.3 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化工藝

通過單因素考察，選取對微乳性質(zhì)影響較顯著的3個因素：制備溫度（Temperature，X1）、均質(zhì)壓力（Pressure，X2）和均質(zhì)次數(shù)（Times，X3）為考察對象，以粒徑（Y1）、多分散系數(shù)（PDI，Y2）及包封率（EE，Y3）為評價指標(biāo)，利用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化工藝。試驗設(shè)計水平見表2，試驗設(shè)計與效應(yīng)值見表3，三維效應(yīng)面圖見圖1～圖3。

表2 試驗設(shè)計水平表Tab 2 Experimental design level

表3 試驗設(shè)計與效應(yīng)值Tab 3 Experimental design and effect value

2.4 EE的測定

本文采用低溫超速離心法[5]測定藥物在微乳中的EE，方法如下：

藥物總量的測定：精密吸取多西他賽微乳注射液1ml，置于50ml量瓶中，加入甲醇適量，混勻，超聲，0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.1”項下色譜條件測定藥物總量。

水相中藥物含量的測定：取多西他賽亞微乳注射液4ml，置低溫超速離心機中以50000r/min離心1.5h，于溫度4℃，取下層澄清溶液0.5ml，置于25ml量瓶中，以甲醇稀釋定容，0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.1”項下色譜條件測定水相中藥物含量。計算公式：

式中，A為微乳處方中水相所占比例；cw為水相中多西他賽的質(zhì)量濃度；ct為多西他賽總質(zhì)量濃度。

2.5 優(yōu)化工藝參數(shù)驗證

圖1 自變量X與因變量粒徑（Y1）的等高線Fig 1 Contour of independent variable X and the dependent variable particle size（ Y1）

圖2 自變量X與因變量PDI（Y2）的等高線Fig 2 Contour of independent variable X and the dependent variable polydispersity index（ Y2）

根據(jù)“Design expert 8.0.5”試驗設(shè)計軟件得最佳工藝參數(shù)為：制備溫度61℃，均質(zhì)壓力860×105Pa，均質(zhì)次數(shù)7次。按照“2.2”項下方法以優(yōu)化后的工藝參數(shù)制備3批微乳制劑，按照“2.4”和“2.6”項下方法測定微乳的EE、粒徑及PDI。試驗觀測值、模型預(yù)測值及偏差見表4。

由表4可知，試驗觀察值和模型預(yù)測值比較接近，說明模型預(yù)測性良好。

2.6 優(yōu)化后微乳粒徑分布及Zeta電位測定

取多西他賽微乳溶液適量，用蒸餾水稀釋50倍，采用Mastersizer粒度儀測定脂質(zhì)體的粒徑分布和Zeta電位，同時計算PDI，PDI＝Dw/Dn（Dw為重均粒子直徑，Dn為數(shù)均粒子直徑）。詳見圖4。

圖3 自變量X與因變量EE（Y3）的等高線Fig 3 Contour of independent variable X and the dependent variable encapsulation efficiency（ Y3）

表4 多西他賽微乳注射液制備工藝的驗證試驗結(jié)果（n＝3）Tab 4 Results of verification test of preparation process of Docetaxel microemulsion injection（n＝3）

圖4 多西他賽微乳注射液的粒徑分布和Zeta電位Fig 4 Particle size distribution and Zeta potential of Docetaxel microemulsion injection

由圖4可見，微乳平均粒徑為（221.6±13.4）nm，Zeta電位為－30.3mV，計算得PDI為0.095，表明微乳制劑比較穩(wěn)定。

2.7 透射電鏡觀察

采用磷鎢酸負染法制備透射電鏡樣品。將樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，取適量滴于以火棉膠作為支持膜的銅網(wǎng)上，浸泡于2%磷鎢酸溶液中染色2～5min。待銅網(wǎng)干后用透射電鏡觀察微乳的形態(tài)結(jié)構(gòu)和粒度分布，詳見圖5。

由圖5可見，微乳大小均勻，呈圓整、規(guī)則球形，大部分粒子的粒徑在200nm左右，未見過大的粒子，透射電鏡觀察進一步確證了粒度測定的結(jié)果。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取多西他賽微乳，分別放置于2～8℃和25℃保存，進行穩(wěn)定性試驗，并分別在1、2、3個月取樣，測定微乳的粒徑分布、PDI及EE，結(jié)果見表5。

圖5 多西他賽微乳注射液的透射電鏡圖Fig 5 TEM of Docetaxel microemulsion injection

表5 多西他賽微乳注射液的穩(wěn)定性研究結(jié)果（±s，n＝3）Tab 5 Stability study results of Docetaxel microemulsion injectio（n±s，n＝3）

表5 多西他賽微乳注射液的穩(wěn)定性研究結(jié)果（±s，n＝3）Tab 5 Stability study results of Docetaxel microemulsion injectio（n±s，n＝3）

考察指標(biāo)粒徑，nm PDI EE，%0個月2～8℃25℃225.3±9.80.095±0.00493.5±3.21個月212.6±12.40.102±0.00494.4±2.32個月224.6±15.30.097±0.00392.2±4.33個月217±13.50.099±0.00293.1±3.31個月225.3±18.40.101±0.00594.6±1.32個月231.2±19.30.110±0.00692.8±3.63個月229.2±21.30.121±0.00794.8±2.1

由表5可見，多西他賽微乳在低溫（2～8℃）和室溫（25℃）條件下放置3個月均較穩(wěn)定，粒徑、PDI及EE基本無變化。

3 討論

多西他賽在水和油中的溶解度均較低[6]，采用高壓均質(zhì)法制備多西他賽微乳，使多西他賽顆粒溶解并以分子形式存在于磷脂形成的高分子油水界面膜內(nèi)，提高了亞微乳的載藥能力，從而避免了泰素帝?中聚山梨酯80給患者帶來的休克、呼吸困難、低血壓、血管性水腫、風(fēng)疹等不良反應(yīng)。

微乳以其安全低毒、生物相容性好的特點可以作為藥物的優(yōu)良載體[7]，但由于在熱力學(xué)及動力學(xué)上均屬于不穩(wěn)定體系，因此物理穩(wěn)定性是影響載藥微乳產(chǎn)品開發(fā)及投向市場的重要因素。影響微乳物理穩(wěn)定性的因素有很多，主要包括處方組成和工藝條件等。其中前者主要包括表面活性劑的組成及用量、油相的種類、處方的pH值等。根據(jù)文獻[8-9]報道，乳劑的工藝條件如初乳的制備方法、高壓均質(zhì)化的壓力及次數(shù)、制備溫度等均會影響乳劑的粒度大小及分布并進一步影響其穩(wěn)定性。本研究采用高壓均質(zhì)法制備微乳，通過優(yōu)化均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)及制備溫度3個重要工藝參數(shù)，將多西他賽成功制備成粒徑均一、EE較高、穩(wěn)定性較好的微乳制劑。

Zeta電位是微乳表面荷電性質(zhì)與荷電大小的標(biāo)志，是影響微乳行為的重要參數(shù)。為了得到穩(wěn)定的微乳，Zeta電位一般須控制在－20～－45mV范圍內(nèi)，即通過荷電的穩(wěn)定劑提供微粒間靜電層排斥力，可以初步判斷該體系是穩(wěn)定的[10]。本研究制備的微乳的Zeta電位為－30.3mV，穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)進一步表明微乳制劑比較穩(wěn)定。

[1] ten Tije AJ，Verweij J，Loos WJ，et al.Pharmacological effects of formulation vehicles：implications for cancer chemotherapy[J].Clin Pharmacokinet，2003，42（7）：665.

[2] Straubinger RM，Balasubrltmanian SV.Preparation and characterization of taxane-containing liposomes[J].Methods Enzymol，2005，391（3）：97.

[3] 張先林.抗腫瘤藥多西紫杉醇制劑的應(yīng)用研究近況[J].藥學(xué)進展，2006，30（11）：516.

[4] 劉沙，熊非，朱家壁，等.靜脈注射用載藥脂肪乳的研究近況[J].藥學(xué)進展，2010，34（3）：104.

[5] MacFie J.The development of fat emulsion[J].Nutrition，1999，15（7/8）：641.

[6] 陸彬.藥物新劑型與新技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：532-534.

[7] Zhao M，Su M，Lin X，et al.Evaluation of docetaxelloaded intravenous lipid emulsion pharmacokinetics，tissue distribution，antitumor activity，safety and toxicity[J].Pharm Res，2010，27（8）：1687.

[8] Nielloud F，Marti-Mestres G.Pharmaceutical emulsions and suspensions[M].New York：Marcel Dekker Inc，2000：214-215.

[9] 蘇德森，王思玲.物理藥劑學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：144-146.

[10] 馬濤.全合一混合液的穩(wěn)定性[J].中國藥房，2000，11（2）：88.