藻酸雙酯鈉對急性肺損傷模型小鼠的保護作用研究

史斌，黃厚剛（1.成都市第五人民醫院麻醉科，成都611130；2.重慶醫科大學附屬永川醫院麻醉科，重慶402160）

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）是失控的全身炎癥反應綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）在肺部的具體表現[1]。近年研究[2-3]證明，在ALI/ARDS病程中原有的凝血與抗凝、纖溶與抗纖溶、炎癥與抗炎之間的平衡被打破，凝血級聯與炎癥級聯之間相互促進，形成一種自動放大的效應，使病情加重。因此干預凝血系統的異常對控制ALI/ARDS的病情發展具有重要意義。國內外有學者通過使用傳統的抗凝藥，如肝素治療ALI/ARDS，取得了改善低氧血癥和減輕炎癥反應的效果[4-5]。類肝素類藥物藻酸雙酯鈉（Polysaccharide sulphate，PSS）系海藻提取物，是一種新型類肝素海洋藥物，其有明顯的改善細胞變形、調節血脂代謝、抗凝等作用，同時有較強的分散乳化活性，且不易受外界因素的影響[6]，臨床上主要用于心腦血管疾病的治療，但還未見用于預防ALI/ARDS的報道。本實驗首先采用尾靜脈注射脂多糖（LPS）建立小鼠ALI模型，然后尾靜脈注射PSS，研究ALI/ARDS時PSS對小鼠炎癥因子、信號轉導分子的影響，以期為闡明PSS對ALI/ARDS的治療作用及其分子機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

酶標儀（美國Bio-Rad公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；RM2016病理組織切片機（德國Leica公司）；RC 5B高速低溫離心機（美國Sorvall公司）。

1.2 藥品與試劑

PSS原料藥（中國青島海爾藥業公司，批號：20080405，純度：99.9%）；大腸埃希菌LPS（美國Sigma公司，批號：20060814S）；肺組織中核轉錄因子-κB p65（NF-κB p65）免疫組化試劑盒（美國邁新公司）；細胞間黏附因子1（ICAM-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）。

1.3 動物

健康C57BL/6小鼠40只，♂，體質量20～30g，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，合格證編號：SCXK（鄂）2008-0015。實驗前禁食12h，自由飲水。

2 方法

2.1 分組與給藥

將小鼠隨機分為4組，每組10只。對照組，尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）；PSS組，根據文獻[7]報道尾靜脈注射PSS 10mg/kg；模型組，尾靜脈注射LPS 10mg/kg；治療組，先尾靜脈注射LPS 10mg/kg后立即尾靜脈注射PSS 10mg/kg。各組液體注射總量按10～20ml/kg給予。

2.2 檢測指標

各組小鼠注射給藥8h后，斷頸法處死，立即打開胸腔，切取肺組織，取右肺上葉稱質量，取左肺置于4%多聚甲醛溶液中固定，其余肺組織置入液氮中速凍后，－80℃冰箱保存。

2.2.1 肺組織濕干質量比值（W/D）。取各組小鼠右肺上葉肺組織用吸水紙吸干表面水分及血液后，稱濕質量（W）后，置于94℃干燥箱內烘烤48h至恒質量，再稱干質量（D），計算肺組織W/D。

2.2.2 肺組織形態學。取經固定后的每組小鼠的左肺組織，乙醇系列脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚度3μm，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察肺組織形態學變化。

2.2.3 肺組織中TNF-α、ICAM-1的濃度。取各組小鼠冰凍肺組織100mg，充分勻漿，離心后取上清液，采用ELISA法測定肺組織中TNF-α和ICAM-1的濃度，具體按試劑盒要求操作。

2.2.4 肺組織中NF-κB p65活性。采用免疫組化法，按試劑盒說明書操作，加入兔抗NF-κB p65抗體（1∶200），陰性對照采用正常山羊血清代替，以光密度（OD）值為指標檢測各組小鼠肺組織中NF-κB p65活性。采用圖像分析法，通過顯微鏡放大10×10倍攝取圖像，觀察細胞著色情況，著色越明顯，NF-κB p65表達強度越高。

2.3 統計學處理

3 結果

3.1 肺組織W/D變化

與對照組比較，模型組、治療組小鼠肺組織的W/D均明顯增加（P＜0.05）；PSS組小鼠肺組織的W/D差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，治療組小鼠肺組織的W/D明顯減小（P＜0.05），具體結果詳見表1。

3.2 肺組織形態學變化

表1 各組小鼠肺組織W/D及ICAM-1、TNF-α、NF-κB p65水平比較（±s，n＝10）Tab 1Comparison of W/D and ICAM-1，TNF-α and NF-κB p65levels in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表1 各組小鼠肺組織W/D及ICAM-1、TNF-α、NF-κB p65水平比較（±s，n＝10）Tab 1Comparison of W/D and ICAM-1，TNF-α and NF-κB p65levels in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別對照組PSS組模型組治療組W/D 4.13±0.234.21±0.245.35±0.37＊5.05±0.33＊#ICAM-1，ng/L 59.4±7.461.6±7.1185.5±18.8＊75.5±14.5＊#TNF-α，ng/L 258.5±15.7278.4±23.3522.3±35.4＊405.2±26.6＊#NF-κB p65，ng/L 187.25±21.41190.58±19.34256.42±24.45＊＊225.91±20.12＊##

對照組和PSS組小鼠肺組織結構完整，肺泡間隔適中，無水腫、炎癥，肺泡腔清晰；模型組小鼠肺泡間隔增寬，肺泡壁破壞，肺間質水腫，部分肺泡融合，腔內可見滲出、水腫及出血，肺間質炎細胞浸潤；治療組小鼠肺組織上述病理變化較模型組明顯改善，肺泡壁破壞減少，出血及滲出減輕。顯微鏡圖見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化（HE，×100）A.對照組；B.PSS組；C.模型組；D.治療組Fig 1 Pathological change of lung tissue of mice in each grou（pHE，×100）A.control group；B.PSS group；C.model group；D.treatment group

3.3 肺組織中ICAM-1、TNF-α的濃度變化

與對照組比較，模型組、治療組小鼠肺組織中ICAM-1、TNF-α濃度均明顯增加（P＜0.05），PPS組小鼠肺組織中上述指標的差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，治療組小鼠肺組織中ICAM-1、TNF-α濃度均明顯減小（P＜0.05），具體結果詳見表1。

3.4 肺組織中NF-κB p65活性變化

鏡下觀察，對照組和PSS組小鼠肺組織中NF-κB p65表達主要集中在肺泡和巨噬細胞等中，呈淺黃色，以胞漿為主；模型組小鼠肺組織中NF-κB p65表達主要集中在炎癥細胞和支氣管上皮細胞等中，胞漿和胞核的著色明顯加深，呈棕黃色，且胞核染色明顯增多，表達的強度與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，治療組小鼠肺組織中NF-κB p65表達明顯降低（P＜0.01），結果見表1，顯微鏡圖見圖2。

4 討論

圖2 各組小鼠肺組織中NF-κB p65的染色情況（×400）A.對照組；B.PSS組；C.模型組；D.治療組Fig 2 Staining of NF-κB p65in lung tissue of mice in each grou（p×400）A.control group；B.PSS group；C.model group；D.treatment group

內毒素是ALI的主要致病因素之一，是革蘭陰性菌細胞外膜成分，其主要致病物質LPS，具有嚴重的致炎作用。目前認為在ALI/ARDS早期，血管內皮細胞以及單核巨噬細胞在LPS的誘導下可表達TNF-α等細胞因子以及ICAM-1等多種黏附分子。TNF-α和ICAM-1介導多形核白細胞（PMN）與肺微血管內皮細胞黏附后，既可激活PMN釋放彈性蛋白酶等炎性介質降解肺微血管內皮細胞（PMVEC）結構蛋白[8]，又能啟動ICAM-1信號轉導重構PMVEC細胞骨架[9]，致使PMVEC正常的細胞結構和功能受到破壞，通透性增加，形成滲透性肺水腫，導致肺順應性下降和氧合障礙，引發內毒素性ALI。

NF-κB在細胞質中與其抑制蛋白IκB結合以非活性異二聚體形式存在，受細胞因子TNF-α或細菌、病毒、缺氧等刺激后，導致IκB磷酸化而降解。IκB降解使NF-κB游離，轉位到核內，與靶基因上的κB位點結合而啟動基因轉錄，發揮一系列細胞效應[10]。本研究在給予LPS后8h，免疫組化定位顯示NF-κB活化轉位至細胞核內，上調TNF-α和ICAM-1濃度，這與文獻[11]結果一致。給予治療劑量的PPS后，抑制了NF-κB p65的活化，說明PPS對ALI模型小鼠的保護作用通過抑制NF-κB p65細胞信號通路發揮效應。

與對照組比較，PSS組小鼠未見明顯的肺損傷以及TNF-α、ICAM-1和NF-κB的相應改變，說明在實驗劑量（10mg/kg）內對小鼠無明顯副作用。

綜上所述，PPS能對LPS誘導的ALI模型小鼠具有保護作用，可能是通過抑制NF-κB p65的活化、下調TNF-α和ICAM-1濃度而發揮作用。但相關的具體作用機制以及其保護作用與劑量的相關性有待進一步的研究。

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