他莫昔芬對肝癌HepG2細胞脂質代謝的影響

李 霞，周望溪，席美鳳（湖南永州市中心醫院北院藥劑科，湖南永州 425000）

他莫昔芬（Tamoxifen）是一種選擇性雌激素受體調節劑，被廣泛應用于治療乳腺癌和婦科惡性腫瘤[1-3]。根據國內外研究[4-5]表明，43%的患者在使用他莫昔芬后兩年內都會產生非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），導致肝臟脂質沉積，并可能進一步發展為脂肪型肝炎和肝硬化。近年來關于他莫昔芬導致脂肪肝的體外分子機制研究報道較少。本研究擬通過建立他莫昔芬誘導肝細胞產生脂質沉積模型，探討他莫昔芬對肝細胞脂質合成與代謝途徑的影響，并進一步明確其導致肝細胞脂質沉積可能的分子機制，為選擇和開發治療乳腺癌和婦科腫瘤更加安全和有效的藥物提供理論基礎。

1 材料

CFX96TM聚合酶鏈式反應（PCR）儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；BX51顯微鏡（日本Olympus公司）。

他莫昔芬原料藥（批號：T5648，純度：≥99%）和棕櫚酸原料藥（批號：57-10-3，純度：≥99%）均購自美國Sigma-Aldrich公司；Trizol試劑（美國Invitrogen生命技術公司，批號：15596026）；乙酰輔酶A羧化酶（ACC）一抗及其磷酸化（PACC）一抗（美國Abcam公司，批號：ab63531、ab31931）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔二抗、MTT試劑（中國碧云天生物技術研究所，批號：A0208、ST316）；1640培養基和胎牛血清（美國Hyclone公司，批號：SH30809.01B、SV300087.02）。

人肝癌HepG2細胞，由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所提供。

2 方法

2.1 細胞培養

將HepG2細胞復蘇后接種于50ml細胞培養瓶，用含10%胎牛血清的1640培養基培養，置于37℃、CO2孵育箱中，2d換液1次，傳代至第3代時進行試驗。

2.2 HepG2細胞增殖檢測

將HepG2細胞接種于96孔板，接種密度為每孔6000個，分為6組，每組設3個復孔。空白對照組為不作處理的細胞，另外5組分別為用0.5、1、5、15、30μmol/L他莫昔芬處理后的細胞。培養48h后每孔加入20μl的MTT試劑（5mg/ml），繼續培養4h后吸棄培養基，每孔加入150μl的二甲基亞砜，充分混勻后用酶標儀于490nm波長處測定各孔的光密度（OD）值。OD值越大，則表明細胞增殖越明顯。

2.3 HepG2細胞脂質沉積檢測

將HepG2細胞接種于爬片，分為空白對照組、陽性對照組（200μmol/L棕櫚酸溶液[6]）和0.5、1、5μmol/L他莫昔芬組，每組設3個復孔，分別加入相應藥物處理細胞誘導脂質沉積。各組細胞培養48h后吸棄培養基，4%多聚甲醛固定10min，油紅O染色20min，以質量比為60%的異丙醇分化，蘇木素復染胞核。400倍顯微鏡下觀察各組細胞脂質沉積情況，以細胞內紅色脂滴明顯增多表示脂質沉積明顯。

2.4 HepG2細胞內脂肪酸（FA）合成、氧化相關基因的表達檢測

將HepG2細胞接種于6孔板，分為空白對照組和他莫昔芬（5μmol/L）組，每組設3個復孔，加入相應藥物處理細胞，培養12h后，用Trizol試劑提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA。熒光定量PCR法檢測細胞內FA合成酶（FAS）、固醇調節元件結合蛋白1c（Srebp-1c）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的表達和FA氧化相關基因過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）和解偶聯蛋白2（UCP-2）的表達。引物采用Primer 5軟件設計，FAS上 游 序 列 ：5′-CGCTCGGCATGGCTATCT-3′，下 游 序 列 ：5′-CTCGTTGAAGAACGCATCCA-3′；ACC 上游序列：5′-ATCCGCGGCTATATGAAAACA-3′，下游序列：5′-TCGTAGTGGGCTTGCTGAAA-3′；Srebp-1c上游序列：5′-CGGAACCATCTTGGCAACA-3′，下 游 序 列 ：5′-GCCGGTTGATAGGCAGCTT-3′；PPAR-α上游序列：5′-GGGCACCTGGAGGTATCGT-3′，下 游 序 列 5′-GGGACCCTTATCAATCCTAATCATT-3′；UCP-2上游序列：5′-CCATCTCCTGGGACGTAGCA-3′，下游序列：5′-GGCACATCTGTGGCCTTGA-3′。以他莫昔芬組各基因表達與空白對照組各基因表達的比值為指標。

2.5 HepG2細胞內ACC和P-ACC蛋白表達檢測

將HepG2細胞接種于6孔板，分為空白對照組和他莫昔芬（5μmol/L）組，每組設3個復孔，加入相應藥物處理細胞，培養12h后，分別加入適量的蛋白裂解液于冰上裂解細胞提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。依次進行聚丙烯酰氨凝膠電泳、轉膜、封閉，加入ACC和P-ACC一抗4℃孵育過夜，加入HRP標記山羊抗兔二抗孵育1h，化學發光、顯影、定影，凝膠成像儀采集圖像，結果采用Quantity One軟件進行條帶灰度值分析。

2.6 統計學分析

各組數據采用GraphPad Prism 5軟件分析。各組數據用±s表示，結果采用方差分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

3 結果

3.1 HepG2細胞增殖情況

與空白對照組比較，0.5、1、5μmol/L他莫昔芬對HepG2細胞增殖無明顯影響（P＞0.05），15、30μmol/L他莫昔芬能明顯抑制HepG2細胞的增殖（P＜0.05）。各組HepG2細胞增殖情況比較見表1。

表1 各組HepG2細胞增殖情況比較（±s，n＝3）Tab 1 Comparison of the proliferation of HepG2cells of each group（±s，n＝3）

表1 各組HepG2細胞增殖情況比較（±s，n＝3）Tab 1 Comparison of the proliferation of HepG2cells of each group（±s，n＝3）

與空白對照組比較：＊P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05

OD值1.03±0.041.01±0.050.99±0.080.96±0.090.81±0.02＊0.67±0.05＊組別空白對照組0.5μmol/L他莫昔芬組1μmol/L他莫昔芬組5μmol/L他莫昔芬組15μmol/L他莫昔芬組30μmol/L他莫昔芬組

3.2 HepG2細胞脂質沉積情況

空白對照組HepG2細胞未作任何處理，故細胞內無明顯脂質沉積。與空白對照組比較，5μmol/L他莫昔芬組細胞內紅色脂滴明顯增多，表明出現脂質沉積，且與陽性對照組相似；而0.5、1μmol/L他莫昔芬組細胞內脂質沉積不明顯。各組HepG2細胞內脂質沉積顯微鏡圖見圖1。

3.3 HepG2細胞內FA合成、氧化相關基因的表達情況

圖1 各組HepG2細胞內脂質沉積顯微鏡圖（×400）A.空白對照組；B.0.5μmol/L他莫昔芬組；C.1μmol/L他莫昔芬組；D.5μmol/L他莫昔芬組；E.陽性對照組Fig 1 Microscopic images of lipid accumulation of HepG2cells of each grou（p×400）A.blank control group；B.0.5μmol/L tamoxifen group；C.1μmol/L tamoxifen group；D.5μmol/L tamoxifen group；E.positive control group

與空白對照組（1.00±0）比較，他莫昔芬組細胞內FAS（1.37±0.08）mRNA表達明顯增強（P＜0.05），ACC（1.02±0.18）、Srebp-1c（0.94±0.07）、PPAR-α（0.93±0.06）和 UCP-2（0.93±0.06）mRNA表達無明顯變化。提示他莫昔芬可通過通過增加FA的合成來增加HepG2細胞內的脂質沉積，FA的氧化對減少HepG2細胞內的脂質沉積起著重要作用。

3.4 HepG2細胞內ACC和P-ACC蛋白表達情況

與空白對照組比較，他莫昔芬組細胞內ACC蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），P-ACC蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。兩組HepG2細胞內ACC、P-ACC蛋白表達電泳圖見圖2，表達量比值比較見圖3。

圖3 兩組HepG2細胞內ACC/P-ACC蛋白表達量比值比較與空白對照組比較：＊P＜0.05Fig 3 Comparison of protein expression ratio of ACC to PACC in HepG2cells of 2groupsvs.blank control group：＊P＜0.05

圖2 兩組HepG2細胞內ACC、P-ACC蛋白表達電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of protein expression of ACC and P-ACC in HepG2cells of 2groups

4 討論

在NAFLD病理過程中，一般伴有肝細胞脂質代謝紊亂，富余脂質尤其是甘油三酯（TG）的沉積是NAFLD形成發展的先決條件[7]。在本試驗中，空白對照組與他莫昔芬組均未給予外部FA刺激，5μmol/L他莫昔芬組HepG2細胞內出現明顯的脂質沉積，提示給予他莫昔芬刺激HepG2細胞后，細胞自身合成FA可能是增加的。因此本研究檢測了ACC、FAS、Srebp-1c mRNA的表達水平，結果5μmol/L他莫昔芬組細胞內FAS mRNA表達明顯增強。FAS是合成FA的關鍵酶，位于細胞漿內，普遍表達于肝、腎、腦、肺等組織中，特別是肝臟組織[8]。FAS在催化內源性長鏈FA合成過程中起著重要作用。ACC是FA重頭合成的限速酶，其79位的絲氨酸去磷酸化能使ACC激活，導致FA合成增加[9-10]。因此本研究檢測了ACC及P-ACC蛋白表達，根據結果表明5μmol/L他莫昔芬組細胞內P-ACC蛋白表達明顯降低。由此導致的肝臟自身合成FA增加可能是FA蓄積的原因之一。

此外，正常有效的FA氧化對減少HepG2細胞中的脂質沉積是必要的。FA代謝關鍵調控因子及其控制的關鍵酶，在FA氧化中都起重要作用，其表達和功能發生異常，也是造成FA代謝紊亂主要原因之一[11]。因此本研究檢測了FA氧化相關基因PPAR-α、UCP-2，結果空白對照組與5μmol/L他莫昔芬組無統計學差異。

綜上所述，本次研究首次通過體外細胞模型觀察到他莫昔芬能夠通過增加FA合成來導致HepG2細胞脂質沉積，抑制P-ACC水平是其可能的作用機制之一，為進一步明確其副作用機制和開發新藥提供了理論基礎。

[1] Singh MN，Martin-Hirsch PL，Martin FL.The multiple applications of tamoxifen：an example pointing to SERM modulation being the aspirin of the 21st century[J].Med Sci Monit，2008，14（9）：RA144.

[2] 陳燕妮，王俐，陸澄，等.某院2007－2009年乳腺癌內分泌治療藥利用評估[J].中國藥房，2011，22（18）：1659.

[3] McGonigle KF，Smith DD，Marx HF，et al.Uterine effects of tamoxifen：a prospective study[J].Int J Gynecol Cancer，2006，16（2）：814.

[4] 閆永紅，黨歡，宋光輝，等.乳腺癌術后他莫昔芬治療致脂肪肝[J].中國新藥雜志，2010，19（21）：2016.

[5]Akhondi-Meybodi M，Mortazavy-Zadah MR，Hashemian Z，et al.Incidence and risk factors for non-alcoholic steatohepatitis in females treated with tamoxifen for breast cancer[J].Arab J Gastroenterol，2011，12（1）：34.

[6] Joshi-Barve S，Barve SS，Amancherla K，et al.Palmitic acid induces production of proinflammatory cytokine interleukin-8from hepatocytes[J].Hepatology，2007，46（3）：823.

[7] 汪春燕，郭傳勇.非酒精性脂肪肝的研究新進展[J].保健醫學研究與實踐，2011，8（1）：68.

[8] 趙勵彥，王莉莉，李松.脂肪酸合成酶抑制劑減肥作用機制的研究進展[J].中國藥理學通報，2006，22（7）：780.

[9] Viollet B，Guigas B，Leclerc J，et al.AMP-activated protein kinase in the regulation of hepatic energy metabolism：from physiology to therapeutic perspectives[J].Acta Physiol：Oxf，2009，196（1）：81.

[10] 王光麗，周小輝，傅玉才.非酒精性脂肪性肝病和固醇調節元件結合蛋白1c[J].肝臟，2008，13（3）：257.

[11] 秦艷，張晾，潘杰.高脂飲食對非酒精性脂肪肝影響機制研究進展[J].實用肝病雜志，2010，13（1）：72.