國產齊考諾肽注射液對大鼠鎮痛效果的影響Δ

屠偉峰，鄧麗珍，馬亞平，尹晴，楊學敏，康旭，聶濤（.廣州軍區廣州總醫院麻醉科/全軍臨床麻醉中心，廣州 5000；.深圳翰宇藥業股份有限公司/多肽藥物國家地方聯合工程實驗室，廣東深圳 58057）

神經病理性疼痛是由外傷、腫瘤和感染等各種原因引起的神經損傷，主要表現在損傷愈合后數周甚至數年依然存在疼痛超敏和自發性疼痛等痛覺異常，使得患者痛苦不堪，甚至喪失勞動能力。近來研究發現，N型鈣離子通道阻滯藥齊考諾肽（Ziconotide，ZIC）可產生顯著抗神經病理性疼痛的作用，其強度是嗎啡的300倍，且長時間使用該藥不會產生耐受性和成癮性[1-2]，為頑固性神經病理性疼痛、癌性疼痛的治療帶來了新希望。但由于進口齊考諾肽是直接從芋螺毒素中提取，其成本過高，使得此藥在國內臨床的應用受到極大的限制。為此，深圳翰宇藥業股份有限公司采用化學合成法自主研發出了該產品。但由于其所采取的合成工藝和配合制劑不同，可能造成其鎮痛藥效不同，故本研究以進口齊考諾肽注射液為對照，考察了國產齊考諾肽注射液對大鼠腰5脊神經病理性疼痛的抑制作用，為臨床試驗提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Von Frey Kit觸覺測量套件及其工作臺（意大利Ugo Basile公司）。

1.2 藥品與試劑

齊考諾肽注射液（深圳翰宇藥業股份有限公司，批號：ZIC-2011030101，規格：100μg/ml），齊考諾肽注射液（以色列Elan公司，批號：49191PRN2，規格：100μg/ml），兩種制劑的劑量、外包裝和保存條件完全相同，根據需要用0.9%的氯化鈉溶液（生理鹽水）稀釋成相應濃度的溶液；水合氯醛（天津市百世化工有限公司，批號：20101025，規格：每瓶100g）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，♂，體質量180～220g，由南方醫科大學動物實驗中心和廣東省實驗動物中心提供，合格證編號：SCXK（粵）2006-0015。分籠飼養，自由飲食，室溫23～26℃，相對濕度為55%～65%，白天黑夜各12h循環照明。

2 方法

2.1 建模與鞘內置管

采用經典的腰5脊神經結扎加切斷術建立神經病理性疼痛模型，并進行鞘內置管。具體步驟如下：取大鼠，10%水合氯醛0.35～0.4ml/100g腹腔麻醉后，備皮、消毒，分離左側腰5脊神經，結扎后切斷；再于腰5與腰6脊正中間隙置入長約10cm的PE-10導管，見有清亮腦脊液流出即可；逐層縫合切口，待大鼠蘇醒后，單籠喂養。

2.2 分組與給藥

參考國外經典文獻[3]及預實驗結果進行相應劑量分組，于建模手術后7d（記為7d）將建模成功的大鼠隨機分為7組，每組8只。模型組鞘內注射生理鹽水20μl；國產齊考諾肽低、中、高劑量組鞘內注射國產齊考諾肽注射液，劑量分別為每只30、100、300ng；進口齊考諾肽低、中、高劑量組鞘內注射進口齊考諾肽注射液，劑量分別為每只30、100、300ng，鞘內注射總體積均為每只20μl。

2.3 行為學測試

各組大鼠建模手術前3、1d（記為－3d、－1d）及建模手術后4、6d（記為4d、6d）需進行50%機械性撤足閾值（PWT）的測定；并于建模手術后3、8d（記為3d、8d）進行鞘內導管利多卡因測試，確保給藥時導管位置的正確性及數據的可靠性；建模手術后7d鞘內給藥，監測各組大鼠給藥前1h（記為－1h）及給藥后1、2、4、8h的50%PWT。

2.4 50%PWT的測定

待各組大鼠安靜后，采用Up-Down方法[4]檢測大鼠不同時間點的50%PWT。選8根強度呈對數遞增方式的Von Frey纖維絲（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14g）分別對大鼠后肢左右腳足心部進行機械性刺激，每次刺激持續時間為6～8s。以2.041g為初始刺激強度，若撤足反應為陰性則選用刺激強度遞增的相鄰Von Frey纖維絲繼續刺激；若撤足反應為陽性則選用刺激強度遞減的相鄰Von Frey纖維絲繼續刺激。如此反復，以第一個轉折點的前一點為起點，連續6次的刺激結果為最終的撤足反應模式。根據公式計算50%PWT（g）＝10（Xf+kδ）/10000，式中Xf為最末次測試Von Frey 纖維絲的對數值；k可根據撤足反應模式查表[4]得出；δ為8根Von Frey纖維絲間對數差值的均值。另根據公式計算最大效應百分比（MPE，%），用以評價抗神經病理性疼痛的效果，MPE＝（給藥后撤足閾值－基礎撤足閾值）/（15g－基礎撤足閾值）×100%，其中撤足閾值即為50%PWT，基礎撤足閾值為－1d的50%PWT[5]。

2.5 利多卡因測試

經已置入的鞘內導管給予2%利多卡因10μl，再用10μl生理鹽水沖管，封閉導管外口，觀察給藥后大鼠雙下肢的運動情況。如在30s內出現雙下肢麻痹無法運動，則可認為置入的導管內口位于蛛網膜下腔，表明置管成功。

2.6 統計學分析

運用SPSS 1310統計軟件，采用秩和檢驗和單因素方差分析方法，所有數據以±s表示。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

各組大鼠不同時間點50%PWT的變化見圖1，各組大鼠給藥后不同時間點MPE的變化見表1。

圖1 各組大鼠不同時間點50%PWT的變化與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與同劑量進口齊考諾肽組比較：△P＜0.01Fig 1 Changes of 50%PWT in each group at different time pointsvs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.imported Ziconotide injection at same dose：△P＜0.01

結果表明，每只大鼠鞘內單次注射進口齊考諾肽注射液或國產齊考諾肽注射液30、100、300ng均可劑量依賴性地抑制大鼠神經病理性疼痛超敏反應，給藥后1h內50%PWT達最高值，并在該水平左右可維持4h。與模型組比較，國產和進口齊考諾肽低、中、高劑量組大鼠給藥后各時間點的50%PWT、MPE均明顯增加（P＜0.01），且呈明顯量效關系；與同劑量的進口齊考諾肽組比較，國產齊考諾肽中、高劑量組大鼠給藥后1、2、4h的50%PWT、MPE差異無統計學意義（P＞0.05）。給藥后4h內，國產齊考諾肽低、中、高劑量組大鼠的平均MPE分別為（47.83±15.16）%、（85.12±13.21）%、（99.11±2.53）%，表明中、高劑量組基本甚至完全抑制了模型大鼠的神經病理性疼痛超敏反應。

4 討論

表1 各組大鼠給藥后不同時間點MPE的變化（±s，n＝8）Tab 1 Changes of MPE in each group at different time points（±s，n＝8）

表1 各組大鼠給藥后不同時間點MPE的變化（±s，n＝8）Tab 1 Changes of MPE in each group at different time points（±s，n＝8）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與同劑量進口齊考諾肽組比較：△P＜0.01vs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.imported Ziconotide injection at same dose：△P＜0.01

MPE，%組別模型組國產齊考諾肽低劑量組國產齊考諾肽中劑量組國產齊考諾肽高劑量組進口齊考諾肽低劑量組進口齊考諾肽中劑量組進口齊考諾肽高劑量組1h 0.29±0.8646.65±18.52＊＊△88.18±14.23＊＊100.00±0.00＊＊26.65±11.61＊＊85.75±14.17＊＊100.00±0.00＊＊2h 0.42±0.2952.75±12.45＊＊△86.13±11.50＊＊100.00±0.00＊＊27.36±11.52＊＊82.77±16.67＊＊100.00±0.00＊＊4h 0.25±0.8044.09±14.50＊＊△81.06±13.91＊＊97.32±7.59＊＊18.75±7.83＊75.07±22.53＊＊96.09±3.91＊＊8h 0.36±0.8120.56±13.10＊40.83±22.66＊＊83.65±18.06＊＊7.51±5.5832.69±30.48＊＊79.58±22.18＊＊

N型鈣離子通道與慢性疼痛的形成密切相關，它主要分布于背根神經細胞及脊髓背角神經的突觸末梢，通過觸發谷氨酸及P物質等神經遞質釋放，參與疼痛的傳遞與調控。齊考諾肽作為一種特異性N型鈣離子通道阻滯藥，其鎮痛機制主要是可逆性地阻滯N型鈣離子通道、調控疼痛介質的釋放、阻斷疼痛信號的傳遞，從而緩解或抑制疼痛。目前其已被多個國家批準用于治療各種術后疼痛、慢性疼痛、難治性疼痛，以及對阿片類藥物不敏感的疼痛[6]，其鞘內注射較嗎啡更具潛力且不必擔心藥物的耐受性、成癮性及呼吸抑制。國外眾多專家更是認為齊考諾肽與嗎啡聯合應用是值得推薦的一種鎮痛方案[7]。

本研究結果顯示，國產和進口齊考諾肽對神經病理性疼痛模型大鼠有顯著的鎮痛作用。正常大鼠經建模手術后50%PWT明顯下降，待建模手術后第7天神經病理性疼痛形成后，單次鞘內注射小劑量（每只30ng）國產和進口齊考諾肽注射液便可有效對抗模型大鼠的神經病理性疼痛，如按每只100、300ng劑量注射鎮痛效果更佳。因此可認為，國產和進口齊考諾肽對大鼠腰5脊神經病理性疼痛均具有較好的鎮痛效應。

[1] Schmidtko A，L?tsch J，Freynhagen R，et al.Ziconotide for treatment of severe chronic pain[J].Lancet，2010，375（9725）：1569.

[2] 史學蓮，劉小立.齊考諾肽（ziconotide）：一種非阿片類鎮痛藥物[J].實用疼痛學雜志，2010，6（4）：298.

[3] Bowersox SS，Gadbois T，Singh T，et al.Selective N-type neuronal voltage-sensitive calcium channel blocker，SNX-Ⅲ，produces spinal antinociception in rat models of acute，persistent and neuropathic pain[J].J Pharmacol Exp Ther，1996，279（3）：1243.

[4] Chaplan SR，Bach FW，Pogrel JW，et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J].J Neurosci Methods，1994，53（1）：55.

[5] Hama A，Sagen J.Antinociceptive effects of the marine snail peptides conantokin-G and conotoxin MVIIA alone and in combination in rat models of pain[J].Neuropharmacology，2009，56（2）：556.

[6] Alicino I，Giglio M，Manca F，et al.Intrathecal combination of ziconotide and morphine for refractory cancer pain：a rapidly acting and effective choice[J].Pain，2012，153（1）：245.

[7] Pope JE，Deer TR.Ziconotide：a clinical update and pharmacologic review[J].Expert Opin Pharmacother，2013，14（7）：957.