溫陽通脈方對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的影響及其信號傳導途徑

李彬彬，石月萍

遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州 121001

心肌梗死是嚴重危害人類健康的主要疾病之一。隨著急診溶栓、經皮冠狀動脈介入術、冠狀動脈旁路移植術等再灌注治療方法的推廣，可有效恢復缺血心肌的血供和營養支持。但再灌注治療在恢復心肌血供的同時也帶來心肌的缺血-再灌注 損 傷 (myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)。心肌缺血-再灌注損傷是缺血心肌再灌注之后一種嚴重的甚至致命的病理生理改變，所導致的心肌細胞死亡以往多認為是壞死，但近年來大量研究表明，細胞凋亡也是參與MI/RI中的重要組成部分，其發生、發展還受多種基因調控，通過干預凋亡相關基因蛋白的表達來抑制細胞凋亡，可減輕MI/RI，達到保護心肌的目的[1-5]。古今大量臨床實踐已證實中醫藥能夠有效治療冠心病。因此，探索中醫藥防治心肌細胞凋亡成為防治冠心病新的著眼點。本實驗研究中藥溫陽通脈方對大鼠心肌缺血-再灌注的影響，探討其心肌保護機制。

材料和方法

1 動物 體質量250~300 g健康雄性SD大鼠36只，隨機分為3組，每組12只，購于遼寧醫學院實驗動物中心。

2 藥品、試劑及儀器 溫陽通脈方中藥免煎劑：人參、三七、桂枝、枳實、瓜蔞、薤白等，訂購于華潤三九醫藥股份有限公司(生產批號：1101082S)；蛋白激酶b試劑盒，訂購于北京中杉金橋試劑有限公司；凱基TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒，訂購于南京凱基公司。MCE-1000心電監護儀(深圳遼瑞生物醫療電子股份有限公司)；DH-150型動物人工呼吸機(浙江醫科大學儀器實驗廠)；HC-3018高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司)；數碼照像機；全自動生化檢測儀(日本日立7170A)。

3 分組及給藥 IR組：0.9%氯化鈉注射液灌胃(每只2 ml)2周后穿線結扎大鼠冠狀動脈左前降支，缺血30 min后松開結扎線，使之再灌注120 min；WTF組：中藥免煎劑用0.9%氯化鈉注射液稀釋到合適比例灌胃2周，后穿線結扎大鼠冠狀動脈左前降支，缺血30 min后松開結扎線，使之再灌注120 min；WTF+BA組：中藥免煎劑用0.9%氯化鈉注射液稀釋到合適比例灌胃2周，后穿線結扎大鼠冠狀動脈左前降支，缺血30 min后經尾靜脈注射阻滯劑LY294002后松開結扎線，使之再灌注120 min。

4 大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)再灌注模型的建立 大鼠用20%烏拉坦0.5 ml/kg行腹腔麻醉后于動物手術臺固定，取頸正中切口，分離頸總動脈備實驗過程中動脈插管取血，氣管插管進行機械通氣(呼吸頻率：60/min；潮氣量：10~15 ml；呼吸比1∶3)；于胸骨左旁第2~3肋間行縱行切口，分離胸大肌及肋間肌，結扎肋間動靜脈，剪斷肋骨，破胸膜、心包膜，暴露心臟；在左心耳下緣與肺動脈圓錐間左冠狀動脈前降支起始部使用帶6.0Prolene線的縫合針，自左心室側穿入，由肺動脈圓錐側穿出，留線暫不結扎，待血壓、呼吸穩定10~15 min后再收緊結扎線，結扎之前在預結扎的冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)處放置一根約0.5 cm長直徑1.5 mm的乳膠管；供血區心肌顏色由鮮紅轉為暗紫，心電圖示ST段弓背向上抬高＞0.5 mV，局部心肌變成紫紅色并有節段性運動不良，證實閉塞有效。缺血30 min后剪斷結扎線，使冠狀動脈再通，形成再灌注狀態，松開結扎線前后ST-T峰值下降50%以上，局部心肌變紅，為AMI再灌注模型成功，再灌注120 min后處死動物。

5 心肌梗死范圍測定 再灌注120 min后處死動物立即取出心臟，用0.9%氯化鈉注射液沖洗后吸干水分，留取左心室及室間隔，自心尖到心室基底部將心肌橫切成厚2 mm左右的組織片，放入氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)的溶液(0.5 g/L)中，在37 ℃恒溫水浴中染色15 min后取出沖凈拭干，梗死區心肌未著色，非梗死區呈紫藍色，計算梗死區重量占整個左心室重量的百分數，作為心肌梗死范圍的測定。

6 細胞凋亡率檢測 再灌注120 min麻醉經頸動脈取血后，取出心臟，將缺血區心肌組織(左心室前壁中間段)剪下，10%中性甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的三磷酸脫氧尿甘缺口末端標記法，按照試劑盒說明進行心肌組織切片細胞凋亡的原位檢測。光鏡下正常心肌細胞核呈藍綠色，凋亡細胞核呈深淺不一的棕褐色。每張切片于凋亡細胞分布區域各取5個高倍視野，計算出平均每100個細胞中的凋亡細胞數，并以百分數(%)表示凋亡指數(apoptotic index，AI)。

7 Western blot測 Akt、p-Akt蛋白表達 取 -80 ℃深低溫保存的心肌組織約100 mg，加入1 ml細胞裂解液，勻漿破碎，4 ℃離心15 000 r/min 30 min取上清，BCA法測定蛋白質含量，制成含蛋白量相等的樣品。行SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳。然后將蛋白電轉到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS中封閉，加入一抗，4 ℃封閉過夜；第二日，TBS洗膜3次，加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫下搖床上孵育1 h；按Western blot發光試劑盒說明書顯影，用Bio Rad密度掃描儀進行掃描，測定各蛋白的相對光密度值。

8 統計學處理 采用SPSS13.0軟件統計分析所得數據，所有數據均以表示，兩組間比較采用兩樣本均數的t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 溫陽通脈方對心肌梗死面積的影響 NBT染色法顯示3組大鼠均有梗死心肌，但WTF組較IR組以及WTF+BA組梗死心肌的重量以及梗死心肌重量占左心室重量的百分比明顯減少(見表1)。

2 溫陽通脈方對心肌細胞凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示3組均可見凋亡的陽性細胞，但WTF組較IR組以及WTF+BA組心肌凋亡細胞數量以及心肌細胞凋亡指數(AI)值明顯減少，3組大鼠的心肌細胞凋亡指數(AI)值比較(見表1)，3組大鼠的TUNEL染色結果(見圖1)。

3 溫陽通脈方對PI3K-Akt信號傳導途徑的影響WTF組較IR組及WTF+BA組P-Akt的表達明顯增加；WTF組較IR組及WTF+BA組總Akt的RD無明顯差別；WTF組較IR組及WTF+BA組的P-Akt的RD明顯增加。3組大鼠的Akt和p-Akt的表達情況(見圖2)，3組大鼠的p-Akt的表達比較及Akt和p-Akt的RD值比較(見表2)。

討 論

溫陽通脈方具有溫陽化痰活血的功效，經多年年臨床實踐觀察驗證為治療冠心病不穩定性心絞痛的有效方劑[6]。本實驗通過對心肌梗死范圍的測定發現，WTF組的心肌梗死面積明顯小于IR組及WTF+BA組，表明溫陽通脈方能夠減少大鼠心肌再灌注損傷模型的心肌梗死面積，具有心肌保護作用。有研究表明，氧化應激、鈣超載、內皮功能紊亂以及細胞凋亡等均參與了心肌缺血-再灌注損傷，細胞凋亡是再灌注損傷發病機制的一個重要環節[7-9]。本實驗使用TUNEL法發現WTF組的細胞凋亡數明顯低于對照組，表明溫陽通脈方在一定程度上可能減少大鼠心肌細胞凋亡。

再灌注損傷搶救激酶途徑(reperfusion injury salvage kinase，RISK)的激活是缺血-再灌注損傷的主要保護機制之一。目前發現RISK途徑主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-Akt和細胞外信號調節激酶(p42/p44extra-cellular signal-regulated kinases，ERK1/2)兩條通路。PI3K-Akt是細胞內重要的信號傳導通路，在細胞凋亡、存活，以及增殖等活動中發揮重要的生物學功能。近年來大量實驗證實，缺血預適應和后適應對心肌的保護作用與PI3K-Akt的激活有關，從而抑制心肌細胞凋亡與壞死[10-13]。本實驗研究發現，溫陽通脈方組P-Akt的蛋白表達較IR組及溫陽通脈方+阻滯劑組均明顯增加，證實了溫陽通脈方可能是通過激活PI3-Akt途徑，減少了心肌細胞凋亡，從而達到心肌保護作用。

綜上所述，溫陽通脈方具有心肌保護作用，能夠減少心肌細胞凋亡，其作用的機制可能與PI3K-Akt激酶途徑激活有關。大量實驗及臨床研究也表明中藥在改善血流動力學、保護血管內皮功能、降低缺血再灌注損傷、改善心肌代謝等方面具有保護作用且多層次、多靶點調理內環境，效果顯著[14-16]。在中醫理論指導下，結合現代實驗方法，研究溫陽通脈方對缺血再灌注損傷的保護作用，并探討其機制，對運用中藥防治冠心病，開發臨床減輕心肌缺血-再灌注損傷有效方劑，具有重要的科學意義及廣闊的應用前景。

圖1 3組大鼠的TUNEL染色結果(×400)Fig.1 TUNEL staining of tissue from IR group(A), WTF group(B), and WTF+BA group (C) (×400)

圖2 IR組(A)，WTF組(B)，WTF+BA組(C)P-Akt，Akt的表達Fig.2 Expression of P-Akt and Akt in IR group (A), WTF group(B)and WTF+BA group(C)

表1 三組心肌梗死面積及細胞凋亡指數(AI)比較Tab.1 Myocardial infarction size and AI in 3 groups

表2 三組p-Akt以及Akt和p-Akt的RD值比較Tab.2 RD for p-Akt, Akt and p-Akt in 3 groups

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