復方丹參滴丸降低尿酸和內皮保護作用動物實驗研究

柳 高，朱 平

解放軍總醫院 南樓心血管一科，北京 100853

復方丹參滴丸在臨床的應用日益廣泛，研究顯示該藥對冠心病心絞痛、高血壓左室肥厚、高血脂、腎功能不全等多種疾病均有治療作用。本研究在建立高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)動物模型的基礎上，觀察復方丹參滴丸降低血清尿酸(uric acid，UA)水平和保護血管內皮的效果，并和傳統降尿酸藥物別嘌呤醇進行比較，以求拓展復方丹參滴丸的臨床應用領域，為降尿酸治療開辟新的路徑。

材料和方法

1 實驗藥物與試劑 酵母膏(北京奧博星生物技術責任有限公司，貨號01-014)；別嘌呤醇片(重慶科瑞制藥有限公司)；鹽酸乙胺丁醇片(四川天臺山制藥有限公司)；復方丹參滴丸(天津天士力制藥股份有限公司)；UA試劑盒、NO試劑盒(均為北京方寶生物科技有限公司產品)；兔來源抗小鼠、大鼠、人NF-κBp65(A)抗體，兔來源抗小鼠、大鼠、人VCAM-1(H-276)抗體(均為北京中杉金橋生物醫學技術有限公司提供的Santa-Cruz公司產品，工作濃度1∶100~1∶1 000)。

2 實驗動物及分組 38只SPF級健康雄性昆明小鼠，飼養于本院動物實驗中心，體質量(38.43±3.81) g。隨機分為3組，對照組12只，別嘌呤醇組和復方丹參滴丸組各13只。

3 給藥劑量和方法 對照組(A組)：酵母膏15 g/(kg·d)+乙胺丁醇12.5 mg/(kg·d)+適量蒸餾水；別嘌呤醇組(B組)：(酵母膏和乙胺丁醇劑量同上)+別嘌呤醇20 mg/(kg·d)；復方丹參滴丸組(C組)：(酵母膏和乙胺丁醇劑量同上)+復方丹參滴丸11.57 mg/(kg·d)。給藥容量：0.8 ml/只，1次/d，連續灌胃給藥3周。

4 血液標本收集及檢測 給藥3周后各組小鼠依次用乙醚充分麻醉，摘眼球取血。血液標本按照分組放入4 ℃冰箱冷藏靜置24 h后，在臺式高速低溫離心機10 ℃、3 000 r/min條件下離心5 min。將血清移至EP管中，-20 ℃冰箱分組冷凍保存。使用小鼠血清UA和血清NO酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒分別測定各組血清UA和血清NO水平。

5 主動脈標本NF-κB和VCAM-1檢測 將取血后的小鼠仰臥固定在操作臺上，眼科剪沿左右兩側腋前線剪開胸腔，剪去肺臟，充分暴露心臟。注射器抽取2 ml 10% PBS甲醛溶液由心尖處注入，從主動脈弓處開始分離截取主動脈約2~2.5 cm，同時取下心臟，將主動脈及心臟標本立即放入含有10% PBS甲醛溶液的試管中浸泡固定，經石蠟包埋、切片后進行HE染色，并進行免疫組化檢測NF-κB和VCAM-1的蛋白表達(DAB試劑盒ZLI-9017和SP免疫組織化學染色試劑盒PV-6000：美國Invitrogen公司生產，中杉金橋生物醫學技術有限公司代理)。

6 主動脈形態學觀察 使用OLYMPUS BX60顯微鏡，在400倍視野下重點觀察各組主動脈結構的改變和內膜NF-κB、VCAM-1表達的強弱。

7 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件。定量數據用表示；多組間均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 各組血清UA、NO水平比較 試驗中小鼠均未出現意外死亡。別嘌呤醇組和復方丹參滴丸組血清UA和NO水平與對照組相比差異均有統計學意義(P＜0.01)，提示二者均能顯著降低血清UA水平，并提升血清NO水平；復方丹參滴丸組與別嘌呤醇組血清UA和NO水平差異也存在顯著統計學意義(P＜0.01)，提示復方丹參滴丸降低UA和提升NO的作用更加明顯，見表1。

表1 實驗結束后各組小鼠血清UA、NO水平比較Tab.1 UA and NO level of each group after the trial

2 主動脈標本HE染色 各組主動脈內膜形態和血管壁結構均未發生改變，見圖1。

3 主動脈內膜NF-κB蛋白表達 對照組主動脈內膜NF-κB可見連續陽性表達，別嘌呤醇組和復方丹參滴丸組表達均有減弱，復方丹參滴丸組減弱更加明顯，見圖2。

4 主動脈內膜VCAM-1蛋白表達 對照組主動脈內膜VCAM-1可見連續陽性表達，別嘌呤醇組和復方丹參滴丸組表達均有減弱，復方丹參滴丸組減弱更加明顯，見圖3。

討 論

早期研究提示丹參的有效成分丹參酮ⅡA具有抑制黃嘌呤氧化酶(XO)活性的作用，而XO是體內UA合成的關鍵酶，對于UA的生成意義重大[1]。張霞、吳慧也發現長時間服用治療劑量復方丹參滴丸對XO的活性具有抑制作用[2-3]。本研究中復方丹參滴丸組小鼠血清UA水平與對照組相比下降明顯，證實了復方丹參滴丸具有降低UA的作用，其機制考慮與抑制XO活性，減少了UA的產生有關。

研究提示血清UA水平和血清同型半胱氨酸(Hcy)水平存在正相關，Malinow認為其可能機制是由S-腺苷-同型半胱氨酸產生的腺苷，優先摻入UA的前體池，將Hcy和UA的合成相關聯[4-5]。二者均通過抑制NO產生、增強過氧化物反應和炎性反應等途徑，造成血管內皮損傷[6-7]。Liang等[8]研究顯示，中藥制劑通心絡膠囊能夠上調內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達、激活PI-3K/Akt/HIF依賴的信號途徑，增加NO釋放，從而改善血管內皮功能，減輕高同型半胱氨酸血癥(HHcy)對血管內皮的損傷，而復方丹參滴丸和通心絡膠囊在制藥配方上有相同之處。藥理研究還證明，復方丹參滴丸能清除氧自由基、減少脂質過氧化物、降低血脂，抑制炎癥反應，同時其有效成分丹參素可直接通過調節血管內皮細胞ET-1 mRNA的表達水平，控制ET產生與分泌，提高血中NO濃度，保護血管內皮功能，提示復方丹參滴丸具有直接升高血NO的效果[9]。本研究中復方丹參滴丸引起血清NO水平升高，除上述直接原因外，可能還與UA水平降低后繼而引起Hcy水平下降、或者直接降低Hcy水平有關。動物實驗發現丹參的活性成分之一咖啡酸(caffeic acid，又名3，4-二羥基肉桂酸)具有抑制HHcy加速的小鼠腦靜脈中白細胞滾動和黏附作用，提示其可能成為針對HHcy的治療新策略[10]。但是復方丹參滴丸是否具有降低Hcy的作用及其具體機制，仍有待進一步闡明。

圖1 小鼠主動脈標本HE染色(×400)(箭頭所指為主動脈內膜)A：對照組； B：別嘌呤醇組； C：復方丹參滴丸組Fig.1 HE staining of mouse aorta specimen(×400)(arrow indicates aortic endomembrane)A: control group; B: allopurinol group; C: The Compound Danshen Dripping Pill group

圖2 小鼠主動脈內膜NF-κB蛋白表達(×400)(箭頭所指為主動脈內膜)A：對照組； B：別嘌呤醇組； C：復方丹參滴丸組Fig.2 Expression of NF-κB protein in mouse aortic endomembrane(×400)(arrow indicates aortic endomembrane)A: control group; B: allopurinol group; C: The Compound Danshen Dripping Pill group

NF-κB作為早期轉錄因子，調控參與早期免疫反應和炎癥反應各階段的許多分子，其表達程度可以直觀地反映動脈血管內皮出現炎性反應和損傷的程度。VCAM-1是內皮細胞損傷或活化的標志物，在內皮細胞受損或活化的情況下表達將會明顯增加。本研究的免疫組化結果提示別嘌呤醇和復方丹參滴丸均對血管內皮具有保護作用，而且復方丹參滴丸的保護作用更加顯著。

總之，本研究通過短期動物實驗，初步驗證了復方丹參滴丸具有降低血清UA和保護血管內皮的作用。今后隨著對復方丹參滴丸藥理作用認識的不斷深入，我們在HUA患者中也將開展長期的臨床相關研究，其結果可能在目前傳統降UA藥物不良反應多、療效不佳，且新型降UA藥物比較匱乏的大環境下，為臨床降UA和血管保護治療提供一條嶄新的途徑。

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3 吳慧，張霞．復方丹參滴丸對藥物代謝酶CYP1A2，NAT2和XO活性影響的研究［J］.中國現代應用藥學，2009，26（1）：8-11．

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5 Malinow MR， Levenson J， Giral P， et al. Role of blood pressure， uric acid， and hemorheological parameters on plasma homocyst（e）ine concentration［J］. Atherosclerosis， 1995， 114（2）： 175-183.

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7 王枚，李霞．高同型半胱氨酸血癥與心腦血管疾病關系的研究進展［J］．醫學綜述，2010，16（22）：3444-3447．

8 Liang JQ， Wu K， Jia ZH， et al. Chinese medicine Tongxinluo modulates vascular endothelial function by inducing eNOS expression via the PI-3K/Akt/HIF-dependent signaling pathway［J］. J Ethnopharmacol， 2011， 133（2）： 517-523.

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10 程絲，馮娟，王憲．高同型半胱氨酸血癥治療研究進展［J］.生理科學進展，2011，42（5）：329-334．