低氧濃度與常規氧濃度對胚胎早期發育及妊娠結局的影響

牛子儒，馬慜悅，岳曉靜，張士慧，陸翀曌，王 輝，舒軍萍，彭紅梅，姚元慶

解放軍總醫院 婦產科生殖中心，北京 100853

隨著輔助生育技術的發展，多種胚胎培養系統正在臨床應用，其中培養箱氧氣濃度在各個中心應用有所不同。一些研究顯示在小鼠，牛和豬等哺乳動物的胚胎培養中，降低培養箱內混合氣體的氧氣濃度對胚胎發育有一定好處[1-8]。在一些哺乳動物中已經觀察到子宮內的氧濃度低于輸卵管內的氧濃度。恒河猴輸卵管內的氧濃度是5%~8.7%，而在其子宮內的氧濃度只有約2%[9]。因此，可以認為當胚胎到達子宮時是暴露于一個低氧的環境，同時這也是囊胚形成和植入的時段。有研究指出人類胚胎體外培養在3~5 d時降低氧濃度與在1~5 d時降低氧濃度可以提高相似的卵裂率和妊娠率，提示低氧濃度對8細胞期囊胚更為重要，并與有關子宮內氧濃度較輸卵管內低的研究相一致[9-10]。在人類輔助生殖周期中，傳統胚胎培養箱采用大氣中的氧濃度(約20%)，有研究提出過高的氧濃度可能產生對胚胎有害的物質如氧自由基[11-12]。但有關人類胚胎培養氧濃度影響的研究結果并不一致。有些研究顯示降低氧濃度(5%)未能顯著提高胚胎的質量、著床率和妊娠率。但也有研究顯示低氧濃度可以提高臨床妊娠率和出生率[13-17]。本研究通過評估常規氧濃度(20%)與低氧濃度(5%)對人類胚胎在受精后第1天到第3天的影響，比較兩組胚胎發育和妊娠情況。

資料和方法

1 對象 經患者知情同意后，收集本中心2012年3-11月接受體外受精(in vitro fertiliza-tion，IVF)或卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的周期病例。獲得的受精卵分配到常規氧濃度(20%)或低氧濃度(5%)兩個培養箱中。ICSI主要應用在男性因素所致的不孕(精子密度＜3×106/ml，畸形率＞95%及a+b級精子活力＜50%)和前次IVF受精率低或自然受精障礙的周期。其他周期采用常規IVF方案。排除行附睪/睪丸穿刺活檢-單精子授精(PESA/TESA)及胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)等的周期病例。

2 周期方案 所有周期均根據患者反應情況采用本中心常規超促排卵方案，GnRH激動劑與促性腺素 (human menopausal gonadotropin，HMG)相結合刺激卵泡發育。超聲監測卵泡生長情況，并與激素測定相結合確定取卵時機，給予5 000 IU人絨毛膜促性腺素促排，肌注36 h后陰道超聲引導下取卵，約5 h后進行人工授精或單精子注射。在第3天根據胚胎發育情況、形態、患者年齡、取卵數及其他情況確定是否新鮮移植及移植胚胎數目。對剩余形態學評分較高的胚胎冷凍保存。解凍移植的周期根據其自身情況采用自然或人工周期，同樣移植2個或3個解凍胚胎。根據胚胎透明帶厚度和患者年齡等情況決定是否進行輔助孵化。

3 胚胎培養 卵子和胚胎在覆蓋礦物油(Vitrolife Ovoil)的50 μl和20 μl的培養液(Vitrolife G系列)小滴中培養。采用Therom公司的培養箱，常規氧濃度組(20%)采用5%的二氧化碳和空氣進行氧濃度控制；低氧濃度組(5%)采用5%的二氧化碳、90%的氮氣和空氣進行氧濃度的控制。每天對兩個培養箱的氣體濃度進行監測并在必要時校正。在受精18~20 h后，以是否出現原核來判斷卵子的受精情況[18]。

4 胚胎形態學評分 在受精后第2、3天，根據每一個胚胎的卵裂球數目、大小和碎片等情況進行形態學評分。Ⅰ級，胚胎卵裂球均勻規則，胞質均質透明，透明帶完整，胚胎無或僅有極少(＜5%)碎片；Ⅱ級，卵裂球形態輕度不均勻，胞漿折光性有輕微變化，碎片＜10%，透明帶完整；Ⅲ級，胚胎內碎片＜20%，其余卵裂球形態同Ⅱ級，透明帶完整；Ⅳ級，胚胎內碎片＞20%，碎片外卵裂球具有活細胞特征，胞漿折光性有較大改變，胞漿變黑、顆粒不均勻[19]。

5 評價指標 1)胚胎發育情況：包括正常受精率(正常受精數目/MⅡ數目)，多精受精率(多精受精數目/MⅡ數目)，卵裂率(卵裂數目/受精數目)，優質胚胎率(胚胎評分1或2的數目/所有胚胎數目)；2)妊娠結局包括：生化妊娠率和臨床妊娠率。

6 統計學分析 采用SPSS13.0對數據進行統計分析，采用兩獨立樣本的t檢驗及χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 兩組患者基本情況比較Tab.1 Basic parameters of patients in two groups

表2 兩組胚胎發育與妊娠結局比較Tab.2 Embryo development and pregnancy outcome in two groups(%)

結 果

1 一般資料 共195例周期進入研究，低氧濃度組為101例周期，常規氧濃度組為94例周期。兩組間一般特征如男女方年齡、不孕年限、IVF/ICSI方案、獲卵數及周期移植胚胎數等資料比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2 不同氧濃度對胚胎發育及妊娠結局的影響 兩組多精受精率，D1卵裂率，D2、D3優胚率比較均無統計學差異(P＞0.05)。兩組新鮮移植率，胚胎冷凍率，解凍移植率比較均無統計學差異(P＞0.05)。兩組新鮮移植周期妊娠率，低氧濃度組高于正常氧濃度組(χ2=3.963，P＜0.05)。解凍移植周期妊娠率無統計學差異(P＞0.05)。見表2。

討 論

本研究評價了在胚胎培養混合氣體中降低氧濃度對胚胎發育和IVF/ICSI結局的影響，遺憾的是與常規氧濃度相比，未發現低氧濃度對胚胎質量、早期發育等有明顯益處。但在新鮮移植周期的妊娠率比較中，低氧濃度組的妊娠率高于正常氧濃度組，可以認為經低氧濃度培養的胚胎更利于著床。但解凍周期的胚胎移植妊娠結局未發現兩組有明顯差異。

體內胚胎一直暴露于低氧環境中，從未暴露于20%的氧濃度環境，而這一氧環境被很多學者認為可以產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS包括超氧陰離子基團(O2-)，過氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH)[9,12]。過高的ROS可以導致DNA損傷、線粒體改變、脂質過氧化或蛋白質的氧化改變等[11-12,20]。有研究顯示高氧環境可以改變胚胎的發育潛能[21]。在一些動物研究中發現了高氧環境的不利影響，如在大鼠試驗中，低氧與高氧培養的胚胎桑葚胚和囊胚的發生率及形態學雖然無差異，但低氧培養的胚胎內細胞團數目和著床率顯著高于正常氧濃度組[2]。胚胎早期接觸高氧濃度的危害可能并不直接表現，而是體現在發育后期，從而影響妊娠。最近Nannasy等報道，將胚胎在第1、2天時用20%氧濃度培養，第3~5天時改用5%氧濃度培養，與一直用20%氧濃度組相比，其種植、妊娠或囊胚形成率并未提高。這可能是由于在3-5天時改用低氧濃度培養，并不能改善早期高氧濃度對其造成的損害[22]。

目前胚胎培養系統中混合氣體的氧濃度尚未得到一致定論。有關氧濃度對胚胎發育影響的研究存在很大爭議。Dumoulin等報告低氧與正常氧濃度對胚胎發育和妊娠率的影響無顯著差異，但在延長培養的胚胎中發現低氧濃度可以顯著提高囊胚形成率和囊胚細胞的數量[14]。Bahceci等發現低氧環境第3天的胚胎評分顯著高于正常氧濃度，但臨床結局無顯著差異[15]。Kea等的研究也發現了相似的結果[16]。Meintjes等發現低氧與正常氧的種植率和妊娠率無顯著差異，但囊胚形成率低氧組高于常規氧濃度組[23]。亦有研究顯示低氧可以提高著床與妊娠率[20]。這些研究的結果差異較大，也有可能是由于培養液不同，移植期不同或樣本量不足等造成的。此外，不同人群基線人口學特征也可能導致這一差異。因此還應綜合其他因素來比較這些研究結果。

2011年Gomes Sobrinho等的Meta分析共納入了7個相關研究，其對胚胎受精率、妊娠結局分析指出，目前還沒有證據證明低氧濃度是必須的，雖然有一些關于低氧濃度培養有益的報道，但得出低氧濃度有助于IVF結局的結論還為時尚早，仍需要進一步的隨機對照試驗來證明[24]。2012年來自Cochrane協作網的Bontekoe等人的系統綜述同樣納入了7個研究，通過分析顯示低氧濃度可以提高IVF的出生率，但其納入的研究方法學質量較低，仍需更多高質量的研究來證實[25]。目前這些研究都只關注于形態學和著床情況，今后的研究可以更多關注其他的潛能指標，比如氧濃度導致基因表達的改變[26]。培養小鼠胚胎在Whitten培養液時基因H19的缺失低于在KSOM+AA培養液[27]。另一研究中顯示，在培養液中加入血清可以影響印記基因的表達[28]。這些為將來的氧濃度研究提供了一些可以考慮的檢驗指標。

綜上所述，本研究顯示在低氧濃度中培養胚胎可以提高新鮮移植周期的妊娠率，但并未顯著提高胚胎發育和FET結果。這可能是由于樣本量不足，也可能是由于低氧濃度并不一定對胚胎培養有所改善，亦有可能是低氧濃度僅對3~5 d的囊胚期胚胎發育有所幫助。總之，需要包含更多觀察因素、客觀指標及大樣本的隨機對照研究來發現其差異，客觀說明氧濃度對胚胎發育的影響。

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