心之絡病“孫絡絀急”模型大鼠心肌組織病理變化研究

霍旺 楊明會 李紹旦 王朋

“脈絡—血管系統病”［1］理論認為，脈絡與中小血管以及微循環具有密切相關性，孫絡作為脈絡分支的最末端結構與微血管相對應。孫絡系統功能正常對于保障機體微循環內環境穩態，維持機體正常生理功能具有極其重要的意義。“孫絡絀急”為孫絡一過性或持續性收縮、攣急狀態，是孫絡主要的病理變化之一，與微血管痙攣基本類似［2］。當前越來越多的研究證實，心之病絡“孫絡絀急”作為多種缺血性心臟病的共同病理基礎，參與著各種心系疾病的病理發展過程［3］。因此闡明“孫絡絀急”的微觀病理變化特征對于中醫理論指導臨床多種心系疾病的防治具有重要意義。本研究通過建立大鼠“孫絡絀急”模型，采用心肌組織HE染色、Nagar-Olsen特殊染色及透射電鏡等技術手段，從組織形態學、超微結構等方面探討心之絡病“孫絡絀急”模型下心肌組織病理變化特征，為心之病絡中醫辨證論治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠30只，體重(220±20)g，購自軍事醫學科學院動物中心，動物許可證號:SCXK-(軍)2007-004。按6只/籠飼養于獨立通氣籠具系統內。溫度:(22±1)℃，濕度(50±5)%，每天光照與黑夜時間各12小時。實驗期間造模、取材等操作均在超凈工作臺內進行，添加飼料、換水等由專人負責管理。

1.2 主要藥物與試劑

垂體后葉素(pituitrin，pit)注射液(南京新百藥業有限公司生產，批號:111204);烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司，批號:T20111110);4%多聚甲醛(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號:AR-0211);50%戊二醛(國藥集團化學試劑有限公司，批號:20111215)。

1.3 主要儀器

動物心電圖機(FX-211，北京福田電子醫療儀器);光學顯微鏡(CH-2，日本Olympus公司);多功能顯微鏡帶相機(FDX-35，日本Nikon公司 );透射電子顯微鏡(H-7650，日本日立公司);超薄切片機(UCT，德國萊卡公司)。

1.4 造模及分組處理

“孫絡絀急”大鼠模型參照文獻予股靜脈注射pit方法進行復制［4］，心電圖標準Ⅱ導聯ST段抬高＞0.1 mV說明造模成功。30只大鼠按照隨機數字表法隨機分成正常組和造模5分鐘組、10分鐘組、20分鐘組、30分鐘組5組，每組各6只。各組大鼠20%烏拉坦按5 ml/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉后仰位固定于鼠臺，由四肢皮下插入電極針連接動物心電圖機。大鼠腹股溝處常規消毒，鈍性分離股靜脈，各模型組股靜脈注射pit 6 U/kg(5秒內勻速注射完畢)，正常組注射等量生理鹽水。

1.5 標本處理與觀察

1.5.1 HE染色 各組大鼠摘取心臟，冰浴下取左心室前壁心尖組織，至于4%多聚甲醛中固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制備石蠟切片，超薄切片機切片，切片厚度5μm。形常規HE染色:石蠟切片常規脫蠟水化，蘇木素液染色，1%鹽酸乙醇分化，反藍，乙醇伊紅染色，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織結構并拍照。

1.5.2 Naga-Olsen染色 心肌組織石蠟切片常規脫蠟水化，蘇木精染色1分鐘，清水洗滌，蒸餾水漂洗，堿性復紅液染色3分鐘，丙酮苦味酸溶液分化，丙酮脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察［5］。

1.5.3 電鏡 各組大鼠冰浴下取左室心尖部心肌組織各2塊，每塊體積1 mm ×1 mm ×2 mm，將組織塊固定于2.5%戊二醛中2小時，經磷酸緩沖液沖洗后，1%鋨酸后固定1小時，經丙酮逐級脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片機切片，片厚約70 nm，先后經枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡下觀察。

2 結果

2.1 HE染色

光學顯微鏡下顯示，各模型組心肌細胞胞質、胞核顯示清楚，細胞膜完整界限清楚，心肌肌原纖維可見，未見變性和壞死。心肌細胞間毛細血管管腔內有紅細胞，心內膜平滑。未見炎性細胞。各組間心肌均未見明顯缺血性病理改變，見圖1。

2.2 Naga-Olsen染色

切片經Nagar-Olsen染色后，光學顯微鏡下可見正常心肌組織染成黃色，而缺血心肌組織可見紅染的陽性反應區。與正常組比較，各模型組均可見到大片紅染的陽性反應區域，且尤以10、20分鐘時陽性反應最為明顯，見圖2。

2.3 電子顯微鏡

透射電子顯微鏡下，正常組線粒體膜完整，形態規則，線粒體嵴豐富，排列整齊;模型5分鐘組線粒體明顯腫脹，線粒體嵴稀疏并有少量空泡性變;模型10分鐘組線粒體嵴排列紊亂、斷裂消失甚至呈空泡性變;模型20分鐘組及30分鐘組可見大部分線粒體嵴斷裂消失呈空泡性變，見圖3。正常組心肌細胞可見核膜完整，染色質分布均勻，各模型組電鏡下可見心肌細胞核不規則，染色質邊集，心肌細胞凋亡現象明顯，見圖4。正常組微血管內皮細胞形態完整，細胞核膜完整，染色質分布均勻。各模型組微血管內皮細胞核不規則，染色質不均勻、邊集，凋亡現象明顯，吞飲小泡數量顯著增加，見圖5。

3 討論

“孫絡絀急”是在絡病學理論基礎上提出的新概念。“絀”有屈曲緊急之意，“急”即拘急，“絀急”則意為屈曲拘急，有痙攣之意［6］。既往研究基于血脈與血管在解剖形態學上的同一性，提出了“脈絡—血管系統病”［1］理論，微血管屬于血脈分支脈絡末端之孫絡，從血脈分之而出逐層細分遍布全身的“孫絡—微血管”發揮著滲灌氣血、濡養代謝、津血互換的生理功能。因此微血管病變導致器官組織功能、結構的病理改變與孫絡受損進而導致孫絡病的病理變化具有密切相關性。“脈絡—血管系統病”和“絡病學說”的提出為微血管病變的中醫辨證論治提供了理論依據。有學者在既往研究中通過對“絡脈絀急”相關實驗研究提出了中醫絡脈絀急與現代醫學冠狀動脈痙攣、血管內皮功能紊亂之間的密切相關性［7］，這一理論對于指導冠狀動脈微血管痙攣的中醫辨證研究奠定了堅實的基礎。

本研究采用股靜脈注射垂體后葉素方法建立心之絡病“孫絡絀急”大鼠模型，并通過觀察心肌組織形態及超微結構變化，以探討心之絡病“孫絡絀急”模型下心肌組織超微結構變化特征。本研究結果顯示，各模型組心肌組織HE染色并未見因絀急導致的明顯病理改變，而采用Nagar-Olsen特殊染色處理后在各模型組則均可見到大片陽性反應區，提示“孫絡絀急”在較短時間內即可引起心肌組織明顯缺血，并且其缺血程度尤以造模10分鐘、20分鐘組最為明顯。兩種染色方法結果的差異性究其原因主要與其染色原理有關，HE染色主要基于細胞內酸堿關系的明顯變化或細胞內壞死物質的積聚，而這些病理改變一般發生在細胞死亡后的6至12小時［8］，因此在短時間內并不能看到明顯病理改變。而Nagar-Olsen特殊染色主要基于心肌早期缺血改變與正常心肌對某些色素的著色性質不同而呈現不同的色調，因而可以顯示和判定心肌早期缺血的變化［9］。此結果提示，與HE染色相比Nagar-Olsen特殊染色對早期心肌缺血更為敏感，可作為早期心肌缺血損傷的檢測手段。

心肌細胞超微結構的改變是反映細胞損傷最直觀的指標。線粒體是維持細胞能量的功能單位，對缺血缺氧最為敏感，是反應心肌細胞損傷的敏感指標［9］。本研究結果顯示，投射電鏡下各模型組可見線粒體嵴明顯稀疏、模糊斷裂，甚至出現空泡性變，并且各模型組心肌細胞核不規則，染色質邊集，心肌細胞凋亡現象明顯，此結果提示“孫絡絀急”導致的缺血缺氧在較短時間內即可引起心肌細胞明顯受損。生理狀態下，微血管內皮細胞對于維持血液正常流態、調節微血管張力以及血管內外營養物質交換等方面具有極其重要意義［11］，其結構的完整性是生理功能得以發揮的重要基礎。本研究結果顯示，各模型組均可見微血管內皮細胞細胞核不規則，染色質不均勻、邊集，細胞結構遭到破壞，凋亡現象明顯。提示“孫絡絀急”可加劇微血管內皮細胞凋亡，引起微血管內皮細胞結構破壞，從而導致其正常生理功能發生紊亂。此外，各模型組微血管內皮細胞內吞飲小泡數量顯著增加，亦提示“孫絡絀急”模型下微血管內皮細胞可能通過增加吞飲小泡數量的方式引起微血管內皮細胞通透性改變，從而發揮相應的病理生理作用。

［1］吳以嶺.“脈絡-血管系統病”新概念及其治療探討［J］.疑難病雜志，2005，4(5):285-287.

［2］吳以嶺.“脈絡-血管系統”相關性探討［J］.中醫雜志，2007，49(1):5-8.

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