基于MTT法的波棱瓜子抗肝纖維化用量初步研究

徐和 戴領 沈成英 韓晉 袁海龍

長期以來，中藥臨床功用與質量評控模式不相適宜，臨床應用上中藥的品質含量與臨床用量(質—量)也是分離的，無論藥材中藥效成分量的高低，臨床用量卻未作出調整，導致臨床療效不確切或不穩定。然而事實上，中藥質—量是密不可分、相互依存的。中藥的用量不同于化學藥，化學藥用量與其含量是直接相關的。中醫臨床潛方用藥，面對品質含量相差甚遠的中藥，而臨床用量設置卻未有區別［1-3］。

波棱瓜子是葫蘆科波棱瓜屬波棱瓜(Herpetospermum caudigerum Wall.)的干燥成熟種子［4］，為藏醫常用藥，用于治療赤巴病、肝病、膽病以及消化不良［5］。波棱瓜子具有保肝降酶、抗肝炎病毒等功效［6］，在各大藏醫院廣泛應用，在用于治療肝病的藏藥成方制劑中，有一半以上以波棱瓜子入藥。波棱瓜子藥材中主要藥效成分為木脂素類成分［7］。前期通過對波棱瓜子的研究發現，波棱甲素(herpetrion，PEDX)為波棱瓜子保肝降酶的關鍵藥效組分［8］。然而臨床上，波棱瓜子用于肝病治療時用量多憑經驗總結，為了制定其科學合理的用量范圍，本文以PEDX的量效關系為核心進行研究［9］，通過含量比例進行轉換，制定波棱瓜子質量控制標準含量上下限，將此模式示范應用于中藥抗肝纖維化質量控制方法研究，為實現“中藥質量標準更加貼近臨床，臨床用量更加科學有據”提供新思路和方法，深化中醫藥的量效關系理論［10］。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

波棱瓜子提取物(自制，PEDX含量為20.8%);PEDX對照品(自制，純度超過98%)。人肝星狀細胞系LX-2細胞，購自北京協和細胞庫;DMEM培養液(美國Gbico公司，批號:1255136);胎牛血清(美國HyClone公司，批號:DPEO166);四甲基偶氮唑鹽(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT，批號:1324B37)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，批號:20120305224)均購自美國Amresco公司;乙腈(色譜純，加拿大Promptar公司)，其他試劑均為分析純。

LC-20AT高效液相色譜儀 SPD-M20A檢測器(日本Shimadzu公司);BSA124S型精密電子天平(德國Sartorius公司);XDS-1B型倒置生物顯微鏡(北京京瑞天下科技有限公司);Forma Series II水套CO2培養箱(3110 Series II水套，Thermo Fisher公司);全波長酶標儀(Multiskan GO型，Thermo Scientific公司)。

1.2 PEDX系列樣品HPLC指紋圖譜的建立

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Alltima C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙腈 －2%冰醋酸水溶液(24∶76)，流速:1.0 ml·min－1，檢測波長:280 nm，柱溫:25℃，進樣量:10 μl。

1.2.2 PEDX陰性樣品的制備 稱取波棱瓜子提取物35 g用8倍量溶劑溶解，上中壓硅膠柱制備，其中溶劑由質量比為3∶2的石油醚和丙酮組成，中壓硅膠柱由三支粒度為200～300目的120 g硅膠柱串聯組成，流動相由石油醚∶乙酸乙酯∶丙酮按2∶7∶1的質量比組成，檢測波長為240 nm，流速為120 ml·min－1，收集不含 PEDX 的餾分，回收干燥，即得 PEDX 陰性樣品［11］。

1.2.3 PEDX對照品溶液的制備 精密稱取PEDX對照品8.0 mg，置50 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為160μg·ml－1的PEDX對照品儲備液。

1.2.4 PEDX系列樣品溶液的制備 按表1將不同劑量的PEDX對照品加入到不含該成分的陰性樣品溶液(以下稱陰性樣品溶液)中，制備不同濃度梯度的PEDX系列樣品。溶解，0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液進高效液相色譜儀。

表1 PEDX樣品的加入量

1.3 PEDX系列樣品對LX-2增殖的影響

各系列樣品先用DMSO溶解，再用培養基稀釋到各個不同的濃度，并使 DMSO的濃度低于1.0%［12］，不含藥物的空白溶劑作陰性對照。取對數生長期的 LX-2細胞，用 0.25%胰蛋白酶 －0.02%EDTA消化，按1×104/ml的濃度接種于96孔培養板中，每孔體積200μl，細胞培養24小時后，棄去上清，溫育48小時。棄去上清，按1.2.4項下制備方法加入PEDX系列樣品溶液，每組設6個平行孔，作用6小時，吸去上清液，每孔加入5 mg·ml－1的MTT液20μl，繼續孵育4小時，終止培養，棄去上清液，加入DMSO 200μl，振蕩10分鐘后，在492 nm波長下，用全波長酶標儀測定各孔吸光值(OD492)。根據下面的公式計算各系列樣品的抑制率。

OD1:系列樣品吸光值;OD0:空白溶劑吸光值

1.4 觀察項目

按1.2.1項下色譜條件記錄系列樣品在60分鐘內的色譜圖，并進行指紋圖譜分析。在進行MTT實驗之前，倒置顯微鏡觀察培養細胞的形態，選取生長、形態良好的細胞用于MTT實驗。

1.5 統計學方法

數據采用SPSS 18.0軟件進行統計分析處理，細胞抑制率數據以均數±標準差(x±s)表示。兩組間的均數檢驗采用方差分析，P＜0.05或P＜0.01時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PEDX系列樣品HPLC指紋圖譜

按照1.2.1項下色譜條件記錄60分鐘內的色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版進行分析，指紋圖譜如圖1所示。相似度計算得到S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8 之間的相似度均為1.0，結果表明樣品Ⅰ～Ⅵ相似度良好，最終得到了不同濃度梯度的PEDX系列樣品。陰性樣品在PEDX保留時間處無吸收，在其余特征峰保留時間處均有吸收，說明PEDX與陰性樣品各特征峰間無相互干擾，最終得到不含PEDX的陰性樣品。

圖1 PEDX系列樣品指紋圖譜

2.2 LX-2細胞抑制率的測定

PEDX系列樣品作用于LX-2細胞6小時后的OD492值如表2，根據抑制率計算公式得到各樣品抑制率。建立各系列樣品的量M與細胞抑制率I值的“量—效”關系曲線，如圖2。由PEDX組分的“量—效”關系可知，當“量”增加到一定程度時，相應的“效”增加的幅度減緩，甚至減弱。進一步說明波棱瓜子中PEDX的“量”對其“效”起著至關重要的作用，并不是“量”越大越好，也不是越小就不好。據圖2中的“量—效”關系曲線圖，確定波棱瓜子中藥效組分PEDX的最小有效用量為0.68 mg，這一閾值可作為中藥質量標準含量控制的下限，最大有效用量為8.2 mg，此用量即是方藥安全有效“治療窗”的最大用量，可作為方藥質量標準含量控制的上限。通過含量關系轉換，可知波棱瓜子的最小有效用量為3.27 mg，最大有效用量為39.42 mg。

表2 PEDX系列樣品對LX-2細胞增殖的影響

圖2 PEDX系列樣品的“量—效”關系曲線

3 討論

本研究在前期目標成分研究的基礎上，確定了PEDX為抗肝纖維化的藥效關鍵組分。通過不同劑量PEDX組分的加入，采用體外LX-2細胞增殖實驗進行藥效學評價，闡明“量—效”關系，進而通過“量—效”關系曲線的變化，找到加入的PEDX的最低含量點、最高含量點，再轉換為人用劑量，以此可以制定藥物的“治療窗”或推薦臨床用量范圍，為波棱瓜子抗肝纖維化作用“含量”標準的制定提供了方法［13］。以此闡明中藥的組分含量與臨床用量的相關性，建立面向臨床、關乎藥效的質量控制方法。

該研究模式的關鍵技術在于如何制備陰性樣品，為保障目標成分及其陰性樣品的完整性，分離手段和方法是關鍵。要有高提取率、高回收率、無損、無殘留的成分快速分離技術，即一方面要多快好省地獲得目標成分，同時對剩余陰性樣品要盡可能地保持無損和完整，目前薄層色譜技術和制備型、中壓柱層析系統是較好的解決手段。

該研究結果的獲得及“量”的標準的制定，為實現中藥藥效物質質量控制“找得準、測得準、定得準”目標提供了方法和思路，也為解決目前中藥質控格局“量而不準”的癥結提供參考，有望成為中藥藥效物質質量控制的新模式。

進行面向臨床的中藥質—量一體化研究，建立質量與用量之間換算機制，使臨床用量科學、合理、有據。以點代面，以藥帶方，逐步將此模式推廣應用到其他方藥，從而實現中藥質量控制從質—量分離向質—量一體轉變，為中醫藥臨床合理用藥特別是為實現中藥用量標準從無據可依到有據可依提供有力的科技支撐。

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