Pravastatin抑制心肌成纖維細(xì)胞膠原基因表達(dá)及其機(jī)制研究

鄭舒展，馮 健，余 琴，李家富

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）系心肌細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維過量積聚、膠原含量顯著升高或膠原成分發(fā)生改變的病理過程，是心肌重構(gòu)的一個(gè)重要特征，可導(dǎo)致充血性心力衰竭、惡性心律失常和猝死，因此研究MF的發(fā)生機(jī)制及尋求防治MF的有效措施具有重要的臨床意義。血管緊張素Ⅱ（angiotensionⅡ，AngⅡ）是目前研究表明最重要的致心肌肥厚因子，可直接通過1型受體介導(dǎo)刺激心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CF）增殖，膠原合成［1－2］。他汀類降脂藥物為3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A（HMG－CoA）還原酶抑制劑，近年研究表明該類藥物可延緩心肌重構(gòu)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究擬觀察pravastatin對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CF增殖及膠原合成的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 1～3日齡的 Wistar大鼠（清潔動(dòng)物）20只，雌雄不限，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；RT－PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；AngⅡ、Pravastatin、MTT、甲羥戊酸（Mevalonic acid，MVA）、焦磷酸法呢酯（farnesy－PP，F(xiàn)PP）、焦磷酸牛龍牛兒基牛龍牛兒酯（geranylgeranyl－PP，GGPP）均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下取 Wistar大鼠心室，剪碎，0.125%胰蛋白酶消化分離細(xì)胞，所得全部細(xì)胞置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃、孵箱中培養(yǎng)60～90min，差速貼壁法除去心肌細(xì)胞，剩下的細(xì)胞即為CF。細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，經(jīng)倒置顯微鏡、免疫組化纖維黏連蛋白染色陽性鑒定為CF。將培養(yǎng)的CF分為：（1）空白對(duì)照組（A組）：不加干預(yù)藥物。（2）AngⅡ組（B組）：AngⅡ10－6mol／L。（3）Prav＋AngⅡ 組：Prav 10－6mol／L ＋ AngⅡ10－6mol／L （C組），Prav 10－5mol／L ＋AngⅡ10－6mol／L（D 組），Prav 10－4mol／L＋ AngⅡ10－6mol／L（E組）。（4）Prav10－4mol／L＋AngⅡ10－6mol／L＋MVA10－4mol／L 組（F組）。（5）Prav 10－4mol／L ＋AngⅡ10－6mol／L＋GGPP10－5mol／L 組 （G 組）。（6）Prav 10－4mol／L＋AngⅡ10－6mol／L＋FPP 10－5mol／L組（H 組）。每組重復(fù)4孔。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CF接種于96孔板，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24h后，換1%血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h使細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)靜止期，藥物干預(yù)48h，各組于藥物刺激結(jié)束前4h加入MTT 20μL，4h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入150μL二甲基亞砜，振蕩10 min使使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490nm處測(cè)定吸光度值（A）。

1.2.3 細(xì)胞總RNA提取及RT－PCR 總RNA提取及RTPCR按說明書進(jìn)行，取1μL總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法先逆轉(zhuǎn)錄合成第1條cDNA，Random 9mers作引物，逆轉(zhuǎn)錄酶為AMV，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積為10μL，反應(yīng)條件為：30℃10min，50℃20min，99℃5min，5℃5min，1個(gè)循環(huán)。以cDNA為模板用引物經(jīng)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。引物采用primer primer 5軟件設(shè)計(jì)并由大連寶生物公司合成，引物序列為PICP：上游 5′－TGC CGT GAC CTC AAG ATG TG－3′，下游5′－CAC AAG CGT GCT GTA GGT GA－3′。PCⅢ：上游5′－CCA CCC TGA ACT CAA GAG C－3′，下游 5′－TGA ACT GAA AGC CAC CAT T－3′ 。GAPDH：上 游 5′－ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC－3′，下 游 5′－TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA－3′。PⅠCP，GAPDH 的擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min，94℃30s，60℃30s，72℃2min，共30個(gè)循環(huán)。PⅠCP擴(kuò)增片段大小為462bp，GAPDH片段大小452bp。PCⅢ的擴(kuò)增條件為：94℃3min，94℃30s，54℃30s，72℃2min，共30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物片段大小為212bp。每組RT－PCR重復(fù)3次。PCR產(chǎn)物上樣于2%的瓊脂糖凝膠（含0.5μg／mL溴化乙錠），0.5×TBE作為電泳緩沖液，以5V／cm電壓電泳時(shí)間45 min。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的基因片段／GAPDH片段的條帶光密度值比值來表示其相對(duì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Prav對(duì)AngⅡ刺激下CF增殖的影響 圖1顯示，AngⅡ明顯促進(jìn) CF的增殖，與 A 組比較（P＜0.01）。Prav（10－6mol／L、10－5mol／L、10－4mol／L）呈濃度依賴性的抑制 AngⅡ刺激下的CF增殖。加入MVA、GGPP后F、G組可完全阻斷Prav的抑制作用，與E組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。H組對(duì)Prav的作用無影響，與E組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 Prav對(duì)AngⅡ刺激下成纖維細(xì)胞PⅠCP、PCⅢmRNA表達(dá)的影響 AngⅡ明顯刺激Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因的表達(dá)，與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Prav各濃度組C、D、E組與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），抑制作用具有濃度依賴性。加入 MVA，GGPP后F、G組可完全阻斷Prav的抑制作用，與E組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。H組對(duì)Prav的作用無影響，與E組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、3。

圖1 Prav對(duì)AngⅡ刺激下CF增殖影響各組的比較

圖2 RT－PCR電泳圖

圖3 Prav對(duì)AngⅡ作用下PICP、PCⅢmRNA表達(dá)的影響

3 討 論

心肌成纖維細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生發(fā)展，腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活是心肌纖維化的重要調(diào)控因素，其中AngⅡ是重要的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。本研究顯示AngⅡ直接作用于CF，明顯刺激新生大鼠的心臟CF增殖和膠原基因的表達(dá)。膠原是心肌細(xì)胞外間質(zhì)的主要成分，其中Ⅰ型膠原最多，Ⅲ型次之，膠原網(wǎng)在維護(hù)心臟結(jié)構(gòu)和功能完整性上起重要作用，心肌膠原的組成及含量與心臟的收縮和舒張功能密切相關(guān)［3］。

已有研究表明，他汀類藥物具有減輕心肌重構(gòu)的作用［4－5］，最近一項(xiàng)對(duì)隨機(jī)臨床試驗(yàn)的Meta分析顯示：除了抑制心肌重構(gòu)的作用之外，他汀類藥物還可以增加慢性心力衰竭患者的左室射血分?jǐn)?shù)，改善心臟功能［6］。他汀類藥物的非降脂作用主要在于其抗炎癥、抗氧化，抑制細(xì)胞增殖［7］，抑制生長(zhǎng)因子的表達(dá)［8］等作用。辛伐他汀可抑制脂多糖誘導(dǎo)的CF血管緊張素1型受體的蛋白表達(dá)，從而拮抗AngⅡ的作用［9］。普伐他汀發(fā)揮抗炎效應(yīng)能減少心梗大鼠梗死區(qū)域的膠原含量從而改善心肌重構(gòu)［10］。本研究觀察Prav直接作用于體外培養(yǎng)的CF，顯示Prav呈濃度依賴性的逆轉(zhuǎn)AngⅡ的刺激增殖作用，抑制CF的PICP、PCⅢmRNA表達(dá)，表明Prav從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)膠原的合成，拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化。

他汀類藥物的主要作用機(jī)制是通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMGCoA還原酶，在肝臟抑制膽固醇的合成，同時(shí)也阻斷甲羥戊酸和這一通路上其他重要的類異戊二烯中間體的生成，如MVA、FPP、GGPP等［11］。GGPP和FPP是小 GTP蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的重要脂質(zhì)附屬物，提供異戊二烯基團(tuán)使小GTP蛋白活化從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。小GTP蛋白屬于Ras超家族，包括Ras、Rho和Rac等，由于Rho家族是龍牛兒基化作用的主要目標(biāo)，所以抑制Rho的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性及其與下游效應(yīng)分子Rho激酶的結(jié)合可能是介導(dǎo)他汀類藥物對(duì)血管壁細(xì)胞及心臟細(xì)胞的某些非調(diào)脂效應(yīng)的機(jī)制［12－13］。他汀類藥物抑制HMG－CoA還原酶后，抑制了由MVA代謝產(chǎn)生的GGPP、FPP的合成，從而阻止小GTP蛋白的活化。FPP主要提供法尼酯基團(tuán)，與Ras的活化有關(guān)；Rho蛋白活化依賴于GGPP提供的二牛龍牛兒基團(tuán)，AngⅡ可誘導(dǎo)新生SD大鼠CFBs的Rho激酶mRNA轉(zhuǎn)錄并活化Rho激酶，抑制Rho激酶活化對(duì)AngⅡ刺激的CFBs增殖與膠原合成具有明顯的抑制作用［14］。Porter KE等研究顯示通過抑制Rho的龍牛兒基化或者抑制Rho激酶的活性，可以達(dá)到同使用辛伐他汀后人心房肌成纖維細(xì)胞的增殖受抑制一樣的效果［15］。本實(shí)驗(yàn)表明GGPP逆轉(zhuǎn)Prav的作用而FPP則不能，說明Prav主要通過抑制甲羥戊酸途徑，其中可能抑制Rho蛋白減少成纖維細(xì)胞增殖和膠原基因的表達(dá)，從而減緩心肌纖維化過程。

［1］ Vivar R，Soto C，Copaja M，et al.Phospholipase C／protein kinase C pathway mediates angiotensin Ⅱ－dependent apoptosis in neonatal rat cardiac fibroblasts expressing AT1 receptor［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2008，52（2）：184－190.

［2］ 周有華，王楊，董戰(zhàn)玲，等.NO參與AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞膠原含量的變化［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，15（10）：1193－1197.

［3］ McCurdy S，Baicu CF，Heymans S，et al.Cardiac extracellular matrix remodeling：fibrillar collagens and secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）［J］.J Mol Cell Cardiol，2010，48（3）：544－549.

［4］ Chang SA，Kim YJ，Lee HW，et al.Effect of rosuvastatin on cardiac remodeling，function，and progression to heart failure in hypertensive heart with established left ventricular hypertrophy［J］.Hypertension，2009，54（3）：591－597.

［5］ Zhao XY，Li L，Zhang JY，et al.Atorvastatin prevents left ventricular remodeling in spontaneously hypertensive rats［J］.Int Heart J，2010，51（6）：426－431.

［6］ Zhang L，Zhang S，Jiang H，et al.Effects of statin treatment on cardiac function in patients with chronic heart failure：a meta－analysis of randomized controlled trials［J］.Clin Cardiol，2011，34（2）：117－123.

［7］ 張宇，歐陽平，羅燁，等.普伐他汀對(duì)腫瘤壞死因子－α誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞syndecan－4蛋白表達(dá)的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（5）：998－1001.

［8］ Dai QM，Lu J，Liu NF.Fluvastatin attenuates myocardial interstitial fibrosis and cardiac dysfunction in diabetic rats by inhibiting over－expression of connective tissue growth factor［J］.Chin Med J，2011，124（1）：89－94.

［9］ 劉少偉，趙連友，鄭強(qiáng)蓀，等.脂多糖對(duì)心肌成纖維細(xì)胞血管緊張素Ⅱ2型受體蛋白表達(dá)的影響及辛伐他汀的干預(yù)效應(yīng)［J］.中華高血壓雜志，2007，15（5）：415－418.

［10］Li TS，Takahashi M，Suzuki R，et al.Pravastatin improves remodeling and cardiac function after myocardial infarction by an anti－inflammatory mechanism rather than by the induction of angiogenesis［J］.Ann Thorac Surg，2006，81（6）：2217－2225.

［11］Hernandez－PO，Perez SD，Navarro AJ，et al.Effects of the 3hydroxy 3methylglutaryl－CoA reductase inhibitors，atorvastatin and simvastatin，on the expression of endothelin－1and endothelial nitric oxide synthase in vascular endothelial cells［J］.J Clin Invest，1998，101（12）：2711－2719.

［12］Takemoto M，Liao JK.Pleiotropic effects of 3－h(huán)ydroxy－3－methyl glutaryl coenzyme A reductase inhibitors［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21（11）：1712－1719.

［13］Copaja M，Venegas D，Aránguiz P，et al.Simvastatin induces apoptosis by a Rho－dependent mechanism in cultured cardiac fibroblasts and myofibroblasts［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，255（1）：57－64.

［14］汪祥海，伍衛(wèi)，楊軍，等.Rho激酶在血管緊張素Ⅱ刺激大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成中的作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2007，23（6）：1098－1101.

［15］Porter KE，Turner NA，O′Regan DJ，et al.Simvastatin reduces human atrial myofibroblast proliferation independently of cholesterol lowering via inhibition of RhoA［J］.Cardiovasc Res，2004，61（4）：745－755.