麻黃水提物霧化吸入對哮喘小鼠氣道炎癥的影響＊

王 嬌，熊 瑛，熊 彬，王宋平△

（1.四川省崇州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 611230；2.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種細胞和細胞組份參與的氣道慢性炎癥性疾病，糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘的主要方法，可以多途徑抑制哮喘氣道炎癥，但無法治愈，長期使用可產(chǎn)生不良反應，尋求更安全、有效的哮喘防治方法是當前亟待解決的重要課題。麻黃作為治療咳喘病之要藥，具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利尿消腫之功效［1］，但有關麻黃水提物霧化吸入對哮喘氣道炎癥的影響尚缺乏深入研究。本課題以哮喘小鼠模型為研究對象，觀察麻黃水提物霧化吸入對哮喘小鼠氣道炎癥和白細胞介素－13（IL－13）與嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin）表達的影響，為臨床拓寬麻黃治療哮喘的新途徑提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 24只5～6周齡健康雌性BALB／c小鼠，體質(zhì)量16～20g（購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心），在瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室動物房飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 卵清清蛋白（OVA）購自美國Sigma公司，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑購自武漢博士德生物工程有限公司，小鼠IL－13、Eotaxin ELISA試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，兔抗小鼠IL－13、Eotaxin多克隆抗體購自上海天呈科技有限公司。超聲霧化器：廣東汕頭光電醫(yī)療器械廠產(chǎn)品，電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司，酶標儀：美國Thermo產(chǎn)品，低溫高速離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品，電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品，倒置相差顯微鏡：日本Olympus產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 麻黃水提物的制備 參照文獻［2］將麻黃50g（購于瀘州圣杰藥房）加入500mL純凈水浸泡30min后，煎制1h，濃縮成濃度相當于含生藥1g／mL的水煎劑，貯存于4℃冰箱備用。

1.2.2 動物分組及建立哮喘模型 按照隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為3組：正常對照組、哮喘模型組、麻黃霧化吸入組（麻黃組），每組8只。哮喘模型的建立參考文獻方法［3－4］：除正常對照組外，哮喘模型組和麻黃組小鼠在第0、7天腹腔注射卵蛋白抗原液0.2mL（含100μg卵蛋白和1mg氫氧化鋁）致敏，致敏后第14天經(jīng)鼻吸入2%卵蛋白生理鹽水溶液激發(fā)，每次30min，1次／天，連續(xù)7d。正常對照組用等量生理鹽水代替卵蛋白抗原液進行腹腔注射和經(jīng)鼻吸入致敏和激發(fā)。

1.2.3 給藥方法 麻黃組小鼠在每次經(jīng)鼻吸入卵蛋白抗原液激發(fā)前1h予以麻黃水提液霧化吸入30min，2次／天，連續(xù)7 d。正常對照組和哮喘模型組小鼠用等量生理鹽水代替麻黃水提液霧化吸入，吸入方法和時間同麻黃組。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細胞計數(shù) 各組小鼠末次給藥結束后24h內(nèi)用戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠后，常規(guī)消毒固定，暴露氣管行氣管插管，用PBS緩沖液0.8mL灌洗雙肺，反復抽吸3次，回收灌洗液，回收率大于或等于80%為合格標本。BALF經(jīng)4℃1 500r／min離心10min后，取細胞沉淀用PBS液重懸，細胞懸液注入計數(shù)池，在顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)，再換算成每升BALF的白細胞（WBC）總數(shù)；另取細胞懸液涂于載玻片上，經(jīng)姬姆莎染液染色后計數(shù)嗜酸性粒細胞（EOS）。

1.2.5 支氣管肺組織病理切片及HE染色 取左肺組織于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，厚度5μm、HE染色，光鏡下觀察支氣管及其周圍組織的病理改變。

1.2.6 免疫組化法檢測支氣管肺組織IL－13、Eotaxin的表達 支氣管肺組織切片采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結（SP）法行免疫組織化學染色，操作步驟按試劑盒說明書進行，主要步驟如下：石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O237℃孵育10min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，置0.01mol／L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸修復抗原，正常羊血清工作液封閉，37℃孵育10min，滴加1∶100兔抗鼠多克隆抗體（一抗）4℃孵育過夜（用PBS液代替一抗作陰性對照），PBS沖洗3次，每次5min，滴加生物素標記羊抗兔血清（二抗），37℃孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，自來水沖洗蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。染色結果判斷標準參考文獻［5］：在光鏡下觀察出現(xiàn)棕黃色或黃褐色染色的細胞判定為陽性細胞，每張切片隨機選取5個高倍視野（×400）進行平均光密度測定，取其平均值作為該片代表值，采用Image－pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算平均光密度值（AOD）。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定IL－13、Eotaxin的濃度 取右側(cè)支氣管肺組織100mg加入1mL PBS液研磨勻漿后，3 000r／min離心20min后，取上清液，采用ELISA法測定上清液中IL－13、Eotaxin蛋白的濃度。操作步驟按試劑盒說明書進行，在450nm波長測量各孔樣品的吸光度（OD）值，根據(jù)OD值計算出各樣品中IL－13、Eotaxin蛋白的濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（方差不齊采用Games Howell法，方差齊同采用LSD法進行兩兩比較），兩變量的相關分析采用Bivariate過程的等級Pearson相關法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠一般狀況 哮喘模型組和麻黃組小鼠激發(fā)后可見其煩躁不安，呼吸急促，抓鼻，打噴嚏，行動遲緩或俯臥不動，但麻黃組癥狀較輕，正常對照組無上述表現(xiàn)。

2.2 BALF中 WBC和EOS計數(shù) 哮喘模型組和麻黃組BALF中WBC、EOS計數(shù)明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；但麻黃組BALF中 WBC、EOS計數(shù)均低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 3組小鼠BALF中WBC及EOS計數(shù)比較

表1 3組小鼠BALF中WBC及EOS計數(shù)比較

▲：P＜0.01，與正常對照組比較；★：P＜0.01，與哮喘模型組比較。

組別WBC EOS正常對照組3.75±0.43 0.03±0.01哮喘模型組 17.74±0.79▲ 1.81±0.05▲麻黃組 8.57±0.51▲★ 0.52±0.03▲★

2.3 支氣管肺組織病理形態(tài)學改變 正常對照組見氣道上皮完整，支氣管、細支氣管壁平滑肌層較薄，管腔規(guī)則，無明顯分泌物貯留，黏膜皺襞矮平，肺泡間隔正常，周圍無明顯炎癥細胞浸潤；哮喘模型組支氣管上皮有脫落不完整，氣道上皮細胞增生肥大，管腔有明顯狹窄，平滑肌增厚，支氣管周圍大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增厚，管腔內(nèi)可見黏液栓；麻黃組支氣管周圍及肺泡區(qū)炎癥細胞浸潤及管腔黏液栓均較哮喘模型組減少，支氣管壁肺泡間隔增厚及管腔狹窄均較哮喘模型組減輕，見圖1。

2.4 支氣管肺組織IL－13、Eotaxin免疫組化染色結果 IL－13、Eotaxin陽性表達產(chǎn)物主要位于支氣管上皮細胞及間質(zhì)中炎癥細胞的細胞膜或細胞質(zhì)，呈棕黃色或黃褐色顆粒樣分布。正常對照組可見氣道黏膜、黏膜下層有少量呈棕黃色的陽性細胞；哮喘模型組可見氣道黏膜、黏膜下層、血管周圍、肺泡區(qū)有大量呈棕黃色的陽性細胞，以氣道黏膜上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、炎癥細胞表達明顯。通過分析比較AOD，哮喘組表達均明顯高于正常對照組（P＜0.01）；麻黃組表達相對于哮喘模型組均有減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2、3，表2。

圖1 3組支氣管肺組織病理形態(tài)學改變（HE×200）

圖2 3組支氣管肺組織IL－13蛋白表達（SP×200）

圖3 3組支氣管肺組織Eotaxin蛋白表達（SP×200）

表2 3組支氣管肺組織IL－13、Eotaxin蛋白表達比較

表2 3組支氣管肺組織IL－13、Eotaxin蛋白表達比較

▲：P＜0.01，與正常對照組比較；★：P＜0.01，與哮喘模型組比較。

組別IL－13 Eotaxin正常對照組0.198±0.091 0.188±0.068哮喘模型組 0.448±0.141▲ 0.419±0.103▲麻黃組 0.226±0.08 8★ 0.218±0.057★

2.5 ELISA法測定IL－13、Eotaxin濃度結果比較 哮喘模型組和麻黃組支氣管肺組織勻漿上清液中IL－13、Eotaxin濃度明顯高于正常對照組（P＜0.01），但麻黃組上清液中IL－13、Eotaxin的濃度低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表3。

表3 3組支氣管肺組織勻漿上清液中IL－13、Eotaxin濃度比較

表3 3組支氣管肺組織勻漿上清液中IL－13、Eotaxin濃度比較

▲：P＜0.01，與正常對照組比較；★：P＜0.01，與哮喘模型組比較。

組別IL－13 Eotaxin正常對照組1 145.993±134.669 717.355±60.491哮喘模型組 3 489.909±235.925▲ 1 262.709±114.516▲麻黃組 2 470.610±138.882▲★ 918.608±58.127▲★

2.6 相關性分析 直線相關分析顯示，哮喘模型組EOS計數(shù)與IL－13、Eotaxin表達呈正相關（r＝0.746、0.712，P＝0.033、0.048）；麻黃組 EOS計數(shù)與IL－13、Eotaxin表達也呈正相關（r＝0.729、0.734，P＝0.040、0.038）；IL－13與 Eotaxin在哮 喘組（r＝0.803，P＝0.028）或麻黃組（r＝0.761，P＝0.016）的表達均呈正相關。

3 討 論

哮喘是由多種細胞參與的氣道炎癥和氣道高反應性為特征的慢性炎癥性疾病［6］。EOS是參與氣道炎癥的主要細胞，EOS合成、釋放的各種炎癥介質(zhì)導致支氣管平滑肌收縮，微血管滲漏和黏液分泌增加［7－8］。Eotaxin可趨化EOS聚集到氣道上皮并活化、釋放各種炎癥介質(zhì)導致氣道上皮損傷［9－10］。IL－13是與哮喘發(fā)病直接相關的Th2細胞因子，與氣道黏液高分泌和氣道高反應性密切相關［11－12］，IL－13與 Eotaxin相互作用，共同調(diào)節(jié)EOS在氣道的募集、活化，使氣道炎癥的持續(xù)時間延長［13－14］。

麻黃具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利尿消腫之功效。麻黃堿是其平喘的主要成分，可直接興奮支氣管平滑肌細胞的β受體，舒張支氣管平滑肌。我們先前的研究結果表明，給予麻黃水提物灌胃預處理哮喘豚鼠，氣道上皮損傷、脫落及炎癥細胞浸潤明顯減輕，提示麻黃灌胃具有抑制哮喘豚鼠氣道炎癥的作用［14］，但麻黃口服給藥雖對支氣管平滑肌有舒張作用，但同時對橫紋肌也有興奮作用，使心率加快，外周血管收縮，血壓升高，劑量過大可導致失眠，心煩不安和顫抖［15］。吸入療法是治療呼吸系統(tǒng)疾病的常用方法，與口服給藥相比，霧化吸入給藥具有局部藥物濃度高、起效迅速、所需劑量小、全身不良反應少等優(yōu)點［16］。

本研究中觀察到哮喘小鼠BALF中WBC、EOS計數(shù)較正常對照組明顯增高，氣道上皮細胞增生肥大，大量炎癥細胞浸潤，管腔內(nèi)可見黏液栓，支氣管肺組織中IL－13、Eotaxin的表達量明顯高于正常對照組（P＜0.01），與文獻報道一致［17］。給予麻黃水提物霧化吸入干預后，結果顯示BALF中 WBC、EOS計數(shù)較哮喘模型組小鼠明顯減少（P＜0.01），氣道上皮炎癥程度減輕，支氣管及周圍炎癥細胞浸潤減少，支氣管肺組織中IL－13、Eotaxin蛋白表達減弱，其表達量明顯低于哮喘模型組小鼠（P＜0.01），相關性分析顯示，BALF中EOS計數(shù)與支氣管肺組織中IL－13、Eotaxin的表達量呈正相關。本研究結果表明，哮喘小鼠支氣管肺組織中存在IL－13、Eotaxin蛋白表達上調(diào)，麻黃水提取物經(jīng)霧化吸入途徑給藥可抑制哮喘小鼠的氣道炎癥和EOS浸潤，抑制IL－13與Eotaxin蛋白的表達，這可能是其治療支氣管哮喘的作用機制之一。

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