乳腺癌高表達(dá)基因FAM83A的生物信息學(xué)分析＊

劉 鐳，黃 亮，車清海，趙恩宏，黃 旭，程露陽，肖麗君

（1.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部免疫教研室，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤診治中心，河北 承德 067000；3.吉林市龍?zhí)秴^(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科 132000）

乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤，發(fā)病率已躍居國內(nèi)婦女癌癥發(fā)病首位［1］。X線片篩查受影像學(xué)特點(diǎn)的制約，使很多患者失去了早期發(fā)現(xiàn)的機(jī)會(huì)［2］。篩查腫瘤生物標(biāo)記物對(duì)乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)具有重要意義，成為目前研究的主要焦點(diǎn)［3］。隨著生物數(shù)據(jù)的急劇增長和計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速提高，生物信息學(xué)這一新興學(xué)科得到了前所未有的迅速發(fā)展，尤其是應(yīng)用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)新基因和進(jìn)行功能研究［4］。本文通過腫瘤基因組解剖計(jì)劃（cancer genome anatomy project，CGAP）基因表達(dá)系列分析（SAGE）數(shù)據(jù)庫，全面分析腫瘤組織基因表達(dá)譜，篩選新的乳腺癌高表達(dá)基因，并對(duì)其中一條功能未知的新基因FAM83A進(jìn)行了初步的生物學(xué)分析，為進(jìn)一步深入研究該基因的生物學(xué)功能及其參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞系MDA－MB－231和MCF－7來自承德醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收集5例乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本（均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)），相應(yīng)的距癌灶邊緣2cm以外的癌旁組織，以及5例乳腺纖維瘤組織，各約100mg。標(biāo)本裝入無菌管內(nèi)，迅速投入液氮罐內(nèi)冷凍。

1.2 方法

1.2.1 差異基因的篩選 利用CGAP提供的SAGE Genie數(shù)據(jù)庫，選取數(shù)字基因表達(dá)演示工具。選擇乳腺癌組織和乳腺良性腫瘤兩個(gè)池，設(shè)置F值為2，即表達(dá)差異大于2倍以上；Q為0.1。差異表達(dá)的基因按差異顯著性高低排序，比對(duì)出在短、長序列標(biāo)簽文庫中都出現(xiàn)的差異基因。并對(duì)其中一條功能未知的高表達(dá)序列FAM83A進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析。

1.2.2 序列比對(duì) 利用BLAST軟件檢索EST數(shù)據(jù)庫、nr數(shù)據(jù)庫及pro數(shù)據(jù)庫。將所克隆的基因核苷酸序列與GeneBank中已知核苷酸序列進(jìn)行同源性分析。氨基酸序列相似性分析用NCBI／blastp，多序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析用clustal W。

1.2.3 理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位 對(duì)蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)、疏水性等理化性質(zhì)分析，用 ExPASy－protparam 工具。用PSORTⅡ服務(wù)程序進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 ELM預(yù)測蛋白質(zhì)功能性位點(diǎn)（http：／／elm.eu.org／）［5］。信號(hào)肽及剪切位點(diǎn)預(yù)測用 SignalIP。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測應(yīng)用SOPMA工具。保守結(jié)構(gòu)域用NCBI／CDD預(yù)測。

1.2.5 電子表達(dá)譜分析 以FAM83A為關(guān)鍵詞，通過Uni－Gene庫中的EST表達(dá)情況分析獲得FAM83A基因電子表達(dá)譜。

1.2.6 半定量RT－PCR驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) TRIZOL法提取乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌、癌旁、乳腺纖維瘤組織總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（QIAGEN）操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系25μL，其中包括2.5μL cDNA模板，2.5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液，0.5μL dNTP（10mmol／L），0.5μL Taq DNA 聚合酶，上下游引物各0.5μL。FAM83A 上游引物為：5′－TAG AGG CAG CCA ACA AGC GTG－3′；下游引物為：5′－CCT TTG GAA AGC TGG GCT TGG GAG－3′。反應(yīng)條件為94 ℃，15s；60℃，30s；72 ℃ 1min，30個(gè)循環(huán)。以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）作為反應(yīng)內(nèi)參。取10μL PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌高表達(dá)基因的篩選 最終篩選出33個(gè)在乳腺癌中高表達(dá)的基因，它們多數(shù)在Gene Bank中都被詳細(xì)注釋，并從中選取一條功能未知的明顯高表達(dá)的基因FAM83A。選擇短標(biāo)簽序列搜索后結(jié)果顯示，在38個(gè)乳腺癌短序列標(biāo)簽文庫中，有31個(gè)文庫具有FAM83A代表標(biāo)簽（ATGTACAGGT），共出現(xiàn)1 575次。而在7個(gè)良性乳腺腫瘤短序列標(biāo)簽文庫中，有2個(gè)文庫出現(xiàn)該代表標(biāo)簽，表達(dá)差異為7.46倍。同時(shí)，在23個(gè)乳腺癌長序列標(biāo)簽文庫中，有20個(gè)文庫具有FAM83A代表標(biāo)簽（ATGTACAGGTTTGTAGC），共出現(xiàn)964次。而在5個(gè)良性乳腺腫瘤長序列標(biāo)簽文庫中，只有一個(gè)文庫出現(xiàn)該代表標(biāo)簽，表達(dá)差異為3.14倍。

2.2 FAM83A在GeneBank中的序列比對(duì)結(jié)果及不同剪接體組成 應(yīng)用BLAST工具比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共有6條序列與FAM83A高度同源，多為人類新mRNA序列。其中發(fā)現(xiàn)兩條序列是FAM83A的轉(zhuǎn)錄變異體，GeneBank登錄號(hào)分別為NM＿207006.1和 NM＿032899.4，加上最初發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄變異體，F(xiàn)AM83A共有3個(gè)不同的剪接體。經(jīng)對(duì)FAM83A的多物種氨基酸序列相似性比較，人與長臂猿、小鼠、火雞和爪蟾的相似性分別為98%、87%、64%和41%，可見氨基酸組成在脊椎動(dòng)物中保守性較高。各物種序列大小接近，起始氨基酸都是蛋氨酸。基于FAM83A多序列比對(duì)進(jìn)化樹分析，人和長臂猿在進(jìn)化上最為接近，在其他物種也有比較接近的進(jìn)化來源。

2.3 理化性質(zhì)與亞細(xì)胞定位 FAM83A（AF497803）由367個(gè)氨基酸組成，生物軟件預(yù)測相對(duì)分子質(zhì)量為40 606，等電點(diǎn)為8.97。該蛋白質(zhì)的半衰期在人體網(wǎng)織紅細(xì)胞為30h；不穩(wěn)定指數(shù)為51.49（＞40考慮為不穩(wěn)定），分類為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪指數(shù)為77.06，平均疏水值為－0.346，是親水蛋白質(zhì)。根據(jù)軟件分析，預(yù)測該蛋白質(zhì)在線粒體中表達(dá)的可能性稍大（43.5%），其次分別是細(xì)胞核（34.8%）和細(xì)胞質(zhì)（21.7%）。

2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) ELM預(yù)測發(fā)現(xiàn)有PK、PKA等磷酸化位點(diǎn)，MAPK作用識(shí)別位點(diǎn)，SH2、SH3，RPEL和 WH2結(jié)合基序等，未發(fā)現(xiàn)有保守結(jié)構(gòu)域存在。未預(yù)測出信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。SOPMA方法預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)FAM83A中α螺旋占43.5%，β折疊占5.72%，延伸鏈和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)分別占11.99%和48.5%。

2.5 FAM83A基因表達(dá) 電子表達(dá)譜分析顯示，F(xiàn)AM83A基因在部分正常組織和多種腫瘤中均有表達(dá)，見表1。

表1 FAM83A基因電子表達(dá)譜

2.6 FAM83A在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中的表達(dá) RTPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83A在乳腺癌細(xì)胞系 MDA－MB－231和MCF－7中均有表達(dá)（圖1A）。在5例乳腺癌組織中，3例FAM83A高表達(dá)；而在相應(yīng)的癌旁組織和乳腺纖維瘤中均不表達(dá)，見圖1B～C。

圖1 半定量RT－PCR檢測FAM83A基因的表達(dá)

3 討 論

乳腺是最常發(fā)生良、惡性腫瘤的器官，癌性增生與良性腫瘤有著本質(zhì)的不同，治療方案也完全不同［6］。所以，在篩選乳腺癌高表達(dá)基因時(shí)，臨床工作者希望尋找在癌組織中高表達(dá)，而在良性腫瘤組織中不表達(dá)或低表達(dá)的基因，對(duì)指導(dǎo)臨床的診斷和治療更具有意義。CGAP SAGE數(shù)據(jù)庫能夠全面分析腫瘤組織基因表達(dá)譜、尋找腫瘤特異性表達(dá)新基因［7］。在SAGE文庫中，本研究選擇了乳腺癌和良性乳腺腫瘤兩個(gè)池，提交后看到良性乳腺腫瘤池的文庫在短序列標(biāo)簽中有7個(gè)，長序列標(biāo)簽中有5個(gè)，主要是：乳腺纖維瘤、乳腺肌上皮瘤和良性乳腺間質(zhì)瘤，并最終篩選出乳腺癌高表達(dá)基因FAM83A。而且，半定量RT－PCR結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的可靠性。該基因在乳腺癌細(xì)胞系和多例乳腺癌組織中均高表達(dá)。

目前，F(xiàn)AM83A的研究很少，只是將該基因作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)記物用于外周血的檢測［8－9］，但關(guān)于該基因的功能少見文獻(xiàn)報(bào)道。ELM 分析提示，該蛋白質(zhì)具有 LIG＿14－3－3＿1，LIG＿14－3－3＿3蛋白質(zhì)配體，cylin底物識(shí)別位點(diǎn)和PK、PKA磷酸化位點(diǎn)等。14－3－3蛋白質(zhì)是真核生物中的一類保守蛋白質(zhì)家族，它們?cè)诩?xì)胞中發(fā)揮著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞周期調(diào)控，凋亡和應(yīng)激反應(yīng)以及腫瘤惡性轉(zhuǎn)化等重要的作用，是蛋白質(zhì)間相互作用的媒介和調(diào)節(jié)者［10］。Cyclin底物識(shí)別位點(diǎn)在cyclin／CDK相互作用蛋白質(zhì)中被廣泛發(fā)現(xiàn)。該基序在CDK中的存在增加了（ST）Px（KR）基序的磷酸化水平。它通過cyclin蛋白質(zhì)中的保守區(qū)域被識(shí)別，并與p21Kip cyclin相似的方法結(jié)合［11］。PK和PKA磷酸化位點(diǎn)是信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控中的常見分子結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期中有著廣泛的調(diào)節(jié)作用［12］。

以上分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)在進(jìn)化上保守，從低等到高等動(dòng)物都有相似蛋白質(zhì)的表達(dá)，是不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，可能定位于線粒體上，有著多個(gè)功能位點(diǎn)和基序，提示參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控。特別要提出的是，該基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體，表明它在生物體發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控方面起著重要的作用。該基因在乳腺癌中的高表達(dá)具有顯著意義，很可能是通過使細(xì)胞持續(xù)增生，控制凋亡和改變細(xì)胞周期而發(fā)揮作用的。

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