小腦頂核電刺激干預(yù)在卒中后抑郁大鼠細(xì)胞因子發(fā)病機(jī)制中的作用

李寶強(qiáng)，隋汝波，張 磊，劉欣躍遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州 00；遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 00

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是卒中的常見并發(fā)癥之一，占卒中患者的20%~50%[1]。PSD嚴(yán)重阻礙了卒中患者神經(jīng)功能和日常生活能力的恢復(fù)，并與卒中患者的社交回避和病死率增高密切相關(guān)[2]。Spalletta等[3]認(rèn)為抑郁患者血中炎性細(xì)胞因子水平明顯增加，導(dǎo)致了抑郁。近年大量臨床研究發(fā)現(xiàn)電刺激小腦頂核能顯著改善抑郁癥狀[4]。本文通過電刺激小腦頂核后觀察PSD大鼠海馬組織中炎性細(xì)胞因子水平的變化，進(jìn)而探討電刺激小腦頂核對(duì)PSD大鼠海馬細(xì)胞因子變化的影響。為新型抗抑郁方法的研發(fā)提供依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雄性SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠72只，體質(zhì)量250~350 g(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。許可證號(hào)：SCXK(遼)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物級(jí)別：普通級(jí)。

2 試劑和儀器 RNAiso Plus，TNF-α，IL-6，IL-1β反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒購日本TAKARA公司；無RNA酶水購自美國Thermo公司；IL-1，IL-6，IL-1βRat Elisa Kit購自美國R&D公司。BH6018型四探頭自動(dòng)r計(jì)數(shù)器：北京核儀器廠；ABI PRISM 7900HT熒光定量PCR儀：Sigma；RF-5000熒光分光光度儀：Sigma；腦立體定位儀：中國深圳瑞沃德生命科技有限公司；離心機(jī)1-14K：Sigma；酶標(biāo)儀Sigma 960：Sigma；勻漿機(jī)：Sigma。

3 動(dòng)物分組 將實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，自然晝夜節(jié)律光照，自由攝食進(jìn)水，通風(fēng)良好，(21±2) ℃恒溫。期間訓(xùn)練飲用蔗糖水消耗和曠野實(shí)驗(yàn)(openfield test，OFT)基線值。選擇評(píng)分相近大鼠72只，隨機(jī)分為四組，每組18只。假手術(shù)組：給予假手術(shù)處理，除拴線不插入頸總動(dòng)脈外，余同手術(shù)組；卒中組：行大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)術(shù)；卒中后抑郁(PSD)組：MCAO術(shù)后第3天加以慢性不可預(yù)見的溫和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，小腦頂核電刺激組：CUMS結(jié)合孤養(yǎng)法后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)行小腦頂核電刺激(60 Hz，60 min)，共計(jì)3次，直到CUMS流程結(jié)束。

4 大鼠局灶性腦缺血模型的建立[5](middle cerebral artery occlusion，MCAO) 手術(shù)前12 h禁食不禁水。選用標(biāo)準(zhǔn)大鼠麻醉劑量，以10%水合氯醛3 ml/kg，經(jīng)腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)和迷走神經(jīng)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、ICA的顱外分支翼腭動(dòng)脈，在近心端結(jié)扎CCA，在頸總動(dòng)脈分叉處結(jié)扎ECA，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈。將ICA遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾夾閉，距頸總動(dòng)脈分叉處近心端0.5 cm處將頸總動(dòng)脈剪一小口，插入備好的碳素魚線，去除動(dòng)脈夾，沿著ICA輕輕向前推進(jìn)，注意不要誤入翼鄂動(dòng)脈，當(dāng)?shù)竭_(dá)指定長度(18 mm左右)時(shí)結(jié)扎ICA并固定魚線。假手術(shù)組動(dòng)物，除手術(shù)過程中不插入線栓以外，其他過程相同。以青霉素局部消毒后縫合皮膚。術(shù)后保持環(huán)境溫度在25~30 ℃左右。尤其要注意動(dòng)物頭部的保溫。模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)Horner征。

5 建立大鼠卒中后抑郁模型 CUMS：按Willner等[6]和Katz等[7]的方法：1)禁食禁水20 h，2)禁水17 h，3)傾斜鼠籠，共18 d。孤養(yǎng)：將PSD和FNS組動(dòng)物單籠飼養(yǎng)。

6 行為學(xué)觀察和測試 CUMS開始第7、14、21天，行曠野實(shí)驗(yàn)測試，每周行蔗糖水實(shí)驗(yàn)并測量體重，應(yīng)激結(jié)束后行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。1)曠野實(shí)驗(yàn)：室內(nèi)隔音，測定5 min水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分及中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)和糞便顆粒；2)蔗糖水實(shí)驗(yàn)：20 h禁食禁水后，測定1 h糖水飲用比例(糖水消耗/總液體消耗×100%)；3)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：連續(xù)觀察5 min，累計(jì)大鼠在水中停止掙扎、成漂浮狀態(tài)的時(shí)間。

7 RNA提取和Real time-PCR 動(dòng)物完成觀察時(shí)間后，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，在大鼠盡量安靜的條件下迅速斷頭取腦，在冰盤上迅速分離出病灶側(cè)(正常組相對(duì)應(yīng)側(cè))的海馬區(qū)腦組織，立即放入液氮中保存，按下面不同方法進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。取液氮中保存的各時(shí)間點(diǎn)海馬標(biāo)本，按照RNAiso Plus一步法提取組織總RNA。紫外分光光度計(jì)測定濃度和純度。取總RNA 2 μg用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再行PCR擴(kuò)增。RT-PCR引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：TNF-α：5'-TCT TCT CAT TCC TgC TCg Tgg-3'(上游)，(下游)，5'-CCT CCT TgT Tgg Gac CgA T-3'，長度為110 bp；IL-1β：5'-CCT CgT gCT gTC TgA CCC AT-3'(上游)，5'-gCC ACA ggg ATT TTg TCg TT-3'(下游)，長度為131 bp；IL-6：5'-ACA AAg CCA gAg TCA TTC AgA gC-3'(上 游)，5'-ggA AgT Tgg ggT Agg AAg gAC T-3'(下游)，長度為135 bp；β-Actin：5'-TACATGGTCTACATGTTCCAGTATG-3'(上 游)，(下 游)5'-CAGGAGGCATTGCTGACAATCTTG-3'，長度127 bp。擴(kuò)增條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃15 s，60 ℃ 15 s。反應(yīng)在ABI PRISM 7900HTPCR儀上進(jìn)行。為了控制樣本間mRNA質(zhì)量的變異，同時(shí)檢測βactin基因表達(dá)表達(dá)。結(jié)果采用SDS軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析。

8 ELISA法檢測海馬組織IL-6，IL-1β及TNF-α蛋白表達(dá) 嚴(yán)格按照Rat Elisa Kit說明書操作。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料均用-x±s表示(先經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn))，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件：多組計(jì)量資料顯著性檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析(oneway ANOVA)和兩兩比較(LSD法)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠行為 與對(duì)照組相比，卒中組在應(yīng)激狀態(tài)下，大鼠的體質(zhì)量及糖水消耗略有下降，垂直運(yùn)動(dòng)略有下降(cP＜0.01)；與卒中組相比，PSD組大鼠體質(zhì)量和糖水消耗量下降，垂直運(yùn)動(dòng)降低(aP＜0.01)；FNS組可增加PSD大鼠體質(zhì)量和糖水消耗量，提高垂直運(yùn)動(dòng)水平(bP＜0.01)。見表1。

2 Real time-PCR法檢測海馬組織中IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA表 達(dá) IL-6、IL-1β 及TNF-α 的mRNA在正常大鼠海馬組織中呈低水平表達(dá)，與對(duì)照組比較，在卒中組海馬組織中三種細(xì)胞因子mRNA含量于MCAO術(shù)后應(yīng)激作用下開始增加(P＜0.05)，14 d達(dá)到高峰(P＜0.05)，隨后開始迅速下降；與卒中組比較PSD組三種細(xì)胞因子mRNA水平均不同程度顯著增加(P＜0.05)IL-6 mRNA表達(dá)以后雖有所降低，但三種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)仍均維持于較高水平(P＜0.05)；與PSD組比較，F(xiàn)NS組三種細(xì)胞因子mRNA水平均不同程度降低(P＜0.05)。見圖1。

3 ELISA法檢測海馬組織IL-6，IL-1β及TNF-α蛋白水平的表達(dá)變化 與卒中組比較，PSD組大鼠海馬組織中IL-6，IL-1β及TNF-α的蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)；與PSD組比較，F(xiàn)NS組三種細(xì)胞因子蛋白表達(dá)不同程度降低(P＜0.05)。見圖2。

表1 各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量變化Tab. 1 Weight of rats in different groups at different time points (g)

表2 各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的糖水消耗Tab. 2 Sugar consumption of rats in different groups at different time points (ml)

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的垂直運(yùn)動(dòng)水平Tab.3 Vertical motion of rats in different groups at different time points (cm)

討 論

本研究結(jié)果表明，電刺激小腦頂核后PSD大鼠體質(zhì)量增加，蔗糖水消耗增加，同時(shí)PSD大鼠在曠野試驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分也增加，因此，F(xiàn)NS后PSD大鼠的抑郁癥狀改善。Schutter等[8]在應(yīng)用經(jīng)顱重復(fù)電刺激小腦治療抑郁的研究中證實(shí)，電刺激小腦能顯著改善抑郁癥狀。然而，關(guān)于電刺激小腦頂核治療PSD的基礎(chǔ)研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)也著眼于對(duì)PSD大鼠FNS前后海馬組織炎性細(xì)胞因子基因及蛋白表達(dá)變化的研究。與卒中組相比，PSD時(shí)炎性細(xì)胞因子IL-6，IL-1β及TNF-α水平明顯升高；與PSD組相比，F(xiàn)NS后炎性細(xì)胞因子IL-6，IL-1β及TNF-α表達(dá)顯著降低。目前，PSD的發(fā)病機(jī)制不明，細(xì)胞因子學(xué)說是公認(rèn)的最重要假說，它闡述了PSD后IL-6，IL-1β及TNF-α等炎性細(xì)胞因子水平持續(xù)升高[9-10]。本研究中PSD后炎性細(xì)胞因子升高與此學(xué)說一致。同時(shí)，電刺激小腦頂核可能通過穩(wěn)定細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)改善PSD大鼠的抑郁癥狀。國內(nèi)劉競麗等[11]應(yīng)用電刺激小腦頂核治療PSD患者41例，結(jié)果顯著改善了PSD患者的抑郁癥狀，與本研究結(jié)果相符，但FNS后細(xì)胞因子降低的機(jī)制尚無研究。電刺激小腦頂核能極顯著地抑制炎癥反應(yīng)，降低細(xì)胞因子水平，這種作用主要是通過對(duì)下丘腦外側(cè)區(qū)和室旁核的抑制來完成的[12-13]。這可能是FNS后PSD大鼠抑郁癥狀改善的原因。

圖 1 IL-6、 IL-1β and TNF-α mRNA在PSD大鼠海馬組織中的表達(dá) 與對(duì)照組比較， 卒中組3種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)增加(aP＜0.05)； 與卒中組比較， PSD組3種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)明顯增加(bP＜0.01)； 與PSD組比較， FNS組3種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)下降(cP＜0.05)Fig. 1 Expressions of IL-6, IL-1βand TNF-αmRNA in hippocampal tissues of PSD rats aP＜0.05, vs control group, bP＜0.01, vs stroke group, cP＜0.05, vs PSD group

圖 2 IL-6、IL-1β and TNF-α在PSD大鼠海馬組織中的蛋白含量測定 與對(duì)照組比較，卒中組3種細(xì)胞因子蛋白含量有所增加(aP＜0.05)；與卒中組比較，PSD組3種細(xì)胞因子蛋白含量明顯增加(bP＜0.01)；與PSD組比較，F(xiàn)NS組3種細(xì)胞因子表達(dá)下降(cP＜0.05)Fig. 2 Protein levels of IL-6, IL-1βand TNF-α in hippocampal tissues of PSD ratsaP＜0.05, vs control group, bP＜0.01, vs stroke group, cP＜0.05, vs PSD group

目前臨床抗抑郁藥療效已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，但其價(jià)格昂貴以及不良反應(yīng)給患者造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及身體傷害。本研究結(jié)果表明電刺激小腦頂核能顯著降低PSD大鼠海馬組織細(xì)胞因子水平，進(jìn)而改善PSD大鼠的抑郁癥狀。FNS后降低海馬組織細(xì)胞因子水平的機(jī)制仍不明確，可能與其雙向免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)[14-15]。即維持體內(nèi)免疫系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)：既能提高免疫功能，又能防止免疫系統(tǒng)的矯枉過正，既阻止致炎性細(xì)胞因子的過度生成同時(shí)又防止抗炎性細(xì)胞因子的過度減少，從而穩(wěn)定細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，達(dá)到治療PSD的目的。國內(nèi)外關(guān)于電刺激的神經(jīng)保護(hù)作用研究較多，但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于電刺激對(duì)PSD作用研究的報(bào)道，而其對(duì)PSD時(shí)海馬組織炎性細(xì)胞因子影響的研究更尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從此角度研究電刺激的保護(hù)作用，從而為PSD的治療提供新的思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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