OCT4介導肝細胞去分化過程中巢蛋白的表達及意義探討

李 冰，郭恩凱，郝好杰，申 晶，程 愈，韓為東，母義明

解放軍總醫院，北京 100853 1內分泌科；2分子生物學實驗室

糖尿病是對人類健康威脅最為嚴重的疾病之一，現行的口服藥物和胰島素治療容易造成血糖波動，不能從根本上治療糖尿病[1]。因此人們開始尋求β細胞替代治療的新來源。已有實驗將胰腺發育的關鍵轉錄因子如Pdx-1等直接導入肝細胞中使之轉變為胰島素分泌細胞(insulin producing cell，IPC)，但效率較低，產生的IPC功能不完善[2-4]。OCT4是維持胚胎干細胞多潛能性和自我更新能力的干性基因之一，有實驗證實單獨OCT4可使成體細胞去分化以實現細胞的重編程，如成纖維細胞向造血前體細胞的轉變[5-7]。Nestin是多譜系前體細胞的標志物之一[8]。不同來源的巢蛋白(nestin)陽性細胞可體外誘導為神經細胞、平滑肌細胞、肝細胞以及胰腺內外分泌細胞[9-10]等。本實驗擬探索肝細胞先經去分化再向IPC誘導的重編程路徑，通過觀察nestin在肝細胞經OCT4介導的去分化過程中的表達，為選擇合適的誘導時機提供參考和依據。

材料和方法

1 實驗材料 6~8周雄性C57BL/6小鼠從本院動物中心引進，飼養在無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級動物房內。包裝慢病毒所用的pwpt-GFP、psPAX2、p MDay2G質粒由第二軍醫大學細胞生物教研室胡以平教授提供，pwpt-OCT4質粒由本實驗室構建，293T細胞由本實驗室提供。肝細胞培養液購自ScienCell公司。高糖DMEM、Opti-MEM、RPMI Medium 1640、Knockout血清、非必需氨基酸(nonessential aminoacid，NEAA)、谷氨酰胺(L-glutamine)、β巰基乙醇(b-mercaptoethanol)、RNA提取試劑Trizol、Complete F12 Medium購自Invitrogen公司。膠原酶Ⅳ購自Sigma公司。堿性成纖維生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)購自Peprotech公司。反轉錄試劑盒購自Famantas公司。2×Taq master Mix購自天根生物公司。RT-PCR引物由北京三博遠志生物公司合成(見表1)。肝細胞灌流液1、灌流液2和黏附培養基配置參考文獻[11]。其他化學試劑均為國產分析純。小鼠原代肝細胞分離培養方法見參考文獻[11]。

表1 各上下游引物序列Tab. 1 Sequences of different upstream primers

2 慢病毒包裝及濃縮 培養293T細胞至融合度70%~80%，用定量的質粒(pwpt-GFP，psPAX2，p MD2G及pwpt-OCT4)及轉染試劑PEI包裝出表達OCT4或EGFP的慢病毒，濃縮后分別稀釋至1.5×108pfu/ml。

3 OCT4-慢病毒感染原代肝細胞 使用肝細胞培養液在37 ℃、5% CO2條件下培養分離8 h后的肝細胞，感染0CT4-慢病毒(MOI=15)，并加入polybrene(4 μg/ml)，每次感染12 h，連續感染兩次，中間間隔24 h。平行對照組感染EGFP-慢病毒，感染方式同OCT4-慢病毒組。感染結束后換為去分化培養液(Complete F12 Medium+10% knockout血清+1%NEAA+1 mmol/L L-glutamine + 0.1 mmol/L b-mercaptoethanol+10 ng/ml bFGF+10 ng/ml HGF)。

4 RT-PCR監測肝細胞感染OCT4-慢病毒后ALB、AFP、FOXA2及nestin的表達 將原代肝細胞(0 d)及感染OCT4-慢病毒后3、5、7、9、12、14、16和18 d的肝細胞使用Trizol提取細胞的總RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA的含量。使用Fermentas反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。取1 μl cDNA作為PCR模板，加入2×Taq PCR master Mix 12.5 μl(1×Taq PCR Master Mix)，上、下游引物各1 μl(終濃度0.4 μmol/L)，補足RNAase-free Water至總體積25 μl。以GAPDH作內參。每個基因每一時間點跑3次PCR，將得到的產物跑1%瓊脂糖凝膠分析，產物使用柯達1D電泳分析軟件分析，將檢測基因(ALB，AFP，FOXA2及nestin)與對應時間點的GAPDH條帶灰度作比，根據每個基因對應時間點的3次灰度比值求出均數，將均數和時間作圖(見圖6，7)。

結 果

1 小鼠原代肝細胞分離培養 本實驗采用兩步膠原酶灌流法，用黏附培養基培養6~8 h后肝細胞已貼壁，更換為肝細胞培養液。鏡下觀察：肝細胞活率在90%以上，細胞呈多邊形或不規則形，肝細胞胞體大，多為雙核，折光差，包漿內顆粒豐富。見圖1。

2 OCT4-慢病毒感染肝細胞 為提高慢病毒的感染率，我們采用兩次重復感染法。因EGFP-慢病毒與OCT4-慢病毒包裝濃縮及稀釋過程相同，故平行對照組EGFP陽性比例能間接反映OCT4的感染效率。對照組感染3 d后EGPF陽性率約為15%，說明OCT4-慢病毒的感染效率約為15%(圖2)。用PCR技術檢測到OCT4-慢病毒感染3 d的肝細胞，以OCT4質粒作陽參，未感染的原代肝細胞作陰參，可見感染3 d后外源OCT4已表達，表明病毒攜帶的OCT4基因已整合到肝細胞基因組內并開始轉錄。見圖3。

圖 1 分離8 h后的小鼠原代肝細胞(×200)(左)圖 2 對照組感染3 d后EGFP的表達情況(×200)(中)圖 3 PCR檢測OCT4-慢病毒感染3 d后外源性OCT4的表達(右)Fig. 1 Mouse primary hepatocytes 8 hours after isolation(×200)(left)Fig. 2 EGFP expression in control group 3 days after infection(×200)(middle)Fig. 3 PCR showing exogenous OCT4 expression 3 days after OCT4-lentivirus infection(right)

3 病毒感染后肝細胞形態變化 我們觀察了3 d、7 d、12 d、16 d的肝細胞形態，可見3 d時肝細胞逐漸變圓，細胞為單核或雙核，病毒感染的細胞釋放出包漿內顆粒，折光性略有增強(如圖4)；7 d時肝細胞變為橢圓或類圓形，包漿內顆粒明顯減少，細胞折光性增強，并出現了肝細胞的增殖(圖4中箭頭所指)，增殖的肝細胞為類圓形，體積較小，包漿顆粒較少，折光性較強(圖4)；12 d時肝細胞增殖更為明顯(圖4)；16 d時細胞以增殖的肝細胞為主，原有的肝細胞明顯減少(圖4)，提示病毒感染和去分化過程可能刺激了肝細胞的增殖和分裂。對照組原代肝細胞在體外活性較難維持，故可見隨著培養時間的延長，原代肝細胞數目減少，活性降低。到培養末期以成纖維及其他間質細胞為主。

圖 4 實驗組肝細胞感染OCT4-慢病毒后及對照組原代肝細胞的形態變化，箭頭所示為新生肝細胞(×400)Fig. 4 Morphology of hepatocytes infected with OCT4-lentivirus in experimental group and primary hepatocytes in control group(arrowhead indicates the newly generated hepatocytes,×400)

4 肝細胞去分化過程中nestin的表達 在感染后的0~3 d中，成熟肝細胞標志物ALB表達下降，不成熟肝細胞的標志物AFP以及肝臟發育早期標志物FOXA2表達上升，表明肝細胞在OCT4作用下經歷由成熟到不成熟的去分化過程，同時nestin表達從無到有、由弱變強；在第3~9天內，各基因表達較為恒定。從第12天起，各基因表達逐漸減弱，至18 d時已幾近消失(圖5、6)。可見，nestin 的表達從第3天持續至第12天，結合圖3中的形態變化可見，在此期間肝細胞先丟失原有表型發生去分化，再出現肝細胞增殖。其中，從第3天到肝細胞出現增殖之前的第6天，高表達nestin并已去分化丟失原有表型的肝細胞可能具備了向神經、胰腺、肌肉等誘導的潛能。

圖 5 PCR監測ALB、 AFP、 FOXA2、 nestin以及GAPDH在OCT4-慢病毒感染后3~18 d的表達Fig. 5 PCR showing expressions of ALB, AFP, FOXA2, nestin and GAPDH on days 3 -18 after OCT4-lentivirus infection

圖 6 ALB、 AFP、 FOXA2 mRNA水平的變化趨勢Fig. 6 ALB, AFP and FOXA2 mRNA expression levels

圖 7 Nestin mRNA 水平的變化趨勢Fig. 7 Nestin mRNA expression level

討 論

隨著糖尿病發病率逐年上升，β細胞的替代治療正受到越來越多的關注。肝細胞已被證實可以轉分化為IPC；去分化是指分化細胞失去特有的結構和功能變為具有未分化細胞特性的過程。我們認為，肝細胞先經去分化丟失自身表型，再向IPC誘導，有可能提高重編程的效率和最終得到功能完善的IPC。本實驗結果可見，在OCT4-慢病毒感染的最初3 d內肝細胞已發生了去分化，而重編程另一個重要問題是誘導時機的選擇。Wiese等[8]對胚胎干細胞(ESC)體外培養發現，在擬胚體(EBs)形成早期有大量nestin陽性細胞出現；在將ESC向神經、胰腺、肝臟及肌肉細胞誘導時均出現了nestin與各譜系前體細胞標志物短暫的共表達階段，隨著細胞進一步分化成熟nestin逐漸消失。Milanesi等[12]證實，骨髓來源的nestin陽性細胞可體外誘導為成簇的胰島素分泌細胞及胰腺導管細胞。從胰腺分離得到的nestin陽性細胞可誘導為胰腺內分泌細胞，外分泌細胞及肝細胞[13]。據此可以認為，nestin是多譜系前體細胞的標志物，nestin的出現提示了細胞具有向神經、胰腺等譜系分化的潛能。因此我們通過監測nestin的表達來決定向IPC的誘導時機。本實驗結果顯示，原代肝細胞不表達nestin，而在去分化及增殖的過程中nestin表達增強，可見增殖出現前(3~6 d)高表達nestin的肝細胞可能已具備了向IPC誘導的潛能，此誘導時機為高效產生功能完善的IPC提供了重要的參考和依據。此外，Vaittinen等[14]和Shibuya等[15]證實，nestin在肌肉或神經損傷后的再生過程中表達增強。而且越來越多的證據表明，中間絲蛋白參與了一些主要生物學過程的調節如細胞分化、增殖以及細胞的自我保護等[16-19]。我們首次在OCT4-慢病毒介導肝細胞去分化過程中證實了nestin的上述表達規律。

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