模擬失重致心肌細胞凋亡及其相關機制探討

王永春，伍 靜，張 舒，曹新生，王 冰，石 菲，楊長斌，高 原，杜挺媛，趙疆東，孫喜慶第四軍醫大學 航空航天醫學系航空航天生物動力學教研室，航空航天醫學教育部重點實驗室，陜西西安7003；第四軍醫大學 訓練部，陜西西安 7003

在航天飛行時，重力的消失將引起人體生理系統明顯改變，特別是在中長期失重環境下，可引起機體出現廣泛的心血管系統變化，在心臟中可表現出心肌萎縮、心律失常和心肌代謝異常等變化，嚴重威脅航天員的安全[1]。失重環境導致的心血管功能失調已成為妨礙航天員健康和太空探索能力最重要的難題之一，如何改善心臟功能，維持心血管功能的穩定，已成為防治失重致心血管功能變化的關鍵所在。心肌細胞凋亡在心血管疾病中廣泛存在，心肌細胞凋亡數量和程度的變化對心血管疾病的發生和發展具有直接影響。有關模擬失重環境下心肌細胞凋亡的發生和調控機制尚需進一步闡明。細胞核轉錄因子GATA結合蛋白4(GATA-4)和心肌細胞增強因子2A(MEF2A)在細胞的生長發育、損傷修復及細胞存活中具有重要的調節作用[2-3]。本研究以大鼠心肌細胞為研究對象，旨在觀察回轉器模擬失重對大鼠心肌細胞凋亡相關通路基因及蛋白的影響，為深入研究航天飛行中機體心臟凋亡的分子機制提供理論依據。

材料和方法

1 主要試劑與儀器 1~3 d齡新生Sprague Dawley大鼠購自第四軍醫大學實驗動物中心。DMEM高糖培養基(HyClone公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)，RNA提取試劑盒(Promega公司)，RT-PCR試劑盒(Takara公司)，GATA-4和MEF2A一抗分別購自Immunoway公司，c-myc一抗和羊抗兔二抗購自ABcom公司，ECL發光試劑盒(Pierce公司)。二氧化碳培養箱(美國Kendro實驗室產品公司)，Nikon TS100倒置顯微鏡(Nikon公司)，超凈工作臺(蘇州凈化)，細胞培養專用2D-RWVs回轉器(北京科林恒達科技發展有限公司)，凝膠圖像分析系統(北京天能公司)。

2 細胞處理及分組 實驗分為96 h回轉組和對照組。心肌細胞以含100 ml/L FBS的DMEM高糖培養液常規培養。模擬失重前1 d，將心肌細胞以每片1×105個的細胞密度接種于2.55 cm×2.15 cm的玻片上，置于6孔板中于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養過夜。將玻片插入回轉艙中并灌滿培養液，以30 r/min的速度水平回轉即可完成心肌細胞模擬失重的模擬。對照組置于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中平行培養。細胞分別在回轉和1 G重力環境下培養96 h后，進行后續實驗。

3 RT-PCR檢測 提取各組細胞的總RNA，以紫外分光光度法計算總RNA的濃度，反轉錄獲取cDNA待用。采用25 μl反應體系，其中引物序列為：1)內參GAPDH：上游引物：5'-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3'，下游引物：5'-CGGCCATCACGCCAC AGTTT-3'；2)擴增c-myc：上游引物：5'-AACTTACAATCTGCGAGCCA-3'，下游引物：5'-AGCAGCTCGAATTT CTTCCAGATAT-3'。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以陽性目的條帶/GAPDH基因條帶光密度的比值作為目的mRNA的相對表達量。

4 Western Blot檢測 用RIPA lysis buffer 200μl裂解細胞并提取蛋白，BCA法蛋白定量，取20 μg的細胞蛋白抽提液行SDS-PAGE電泳分離，繼而轉移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉3 h，分別加入c-myc抗體(1∶1 000)、GATA-4抗體(1∶500)及MEF2A抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，HRP辣根過氧化酶二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，化學發光法顯色。用GAPDH為內參照，以陽性條帶與內參照光密度比值作為目的蛋白的相對表達值。

5 統計學處理 所有實驗均在相同條件下重復3次。實驗數據以-x±s表示，采用SPSS11.5軟件進行統計學分析。組間比較結果采用單因素方差分析F檢驗，統計學差異檢驗水準為P＜0.05。

結 果

1 細胞凋亡相關基因及蛋白表達的改變 對照組c-myc mRNA及蛋白呈低量表達，而回轉模擬失重96 h組大鼠心肌細胞c-myc mRNA及蛋白的表達與對照組相比均顯著增加(P＜0.05)，見圖1。

圖 1 模擬失重對心肌細胞c-myc mRNA和蛋白表達的影響A： mRNA結果； B： 蛋白結果 與對照組比較， aP＜0.05Fig. 1 Effect of simulated microgravity on expression of c-myc mRNA (A) and protein (B)in myocardiocytes

圖 2 模擬失重對心肌細胞轉錄因子GATA-4蛋白表達的影響 與對照組比較， aP＜0.05(左)圖 3 模擬失重對心肌細胞轉錄因子MEF2A蛋白表達的影響 與對照組比較， aP＜0.05(右)Fig. 2 Effect of simulated microgravity on expression of GATA-4 protein in myocardiocytes(left)aP＜0.05, vs control groupFig. 3 Effect of simulated microgravity on expression of MEF2A protein in cardiomyocytes(right)aP＜0.05, vs control group

2 轉錄因子GATA-4和MEF2A表達的改變 轉錄因子GATA-4和MEF2A在細胞凋亡的調控中起重要作用，本研究對兩者的表達進行了檢測。心肌細胞回轉模擬失重96 h后，轉錄因子GATA-4和MEF2A蛋白與對照組相比顯著下降(P＜0.05)，提示模擬失重可致轉錄因子GATA-4和MEF2A蛋白表達降低，見圖2、3。

討 論

既往研究發現，所有航天員在飛行后都會出現不同程度的心血管系統適應不良，主要表現為立位耐力下降與運動耐力降低；輕者立位時出現心率增快、血壓驟降、頭暈等；重者在立位時立即發生暈厥，嚴重影響了航天員的健康以及航天任務的完成，成為中長期載人航天的主要限制因素[4]。

航天醫學研究結果表明，失重或模擬失重環境可導致心臟出現每搏量減少、收縮功能降低和心肌電活動異常等變化，并觀察到失重或模擬失重后，動物出現心肌萎縮、心肌細胞脂滴及糖元增多和線粒體變性等結構改變[5]。提示航天飛行后心臟結構及功能的變化可能在失重后心血管適應不良中起重要作用。有研究發現，模擬失重可致肺組織細胞、胃癌細胞、血管內皮細胞凋亡增加，尾懸吊模擬失重大鼠的心肌細胞凋亡率較對照組增高[6-9]。本研究發現，模擬失重致體外培養的心肌細胞出現凋亡相關調控分子c-myc基因及蛋白的表達均顯著增加，進一步證實了模擬失重可增加心肌細胞凋亡。然而，有關失重/模擬失重環境下所致的心肌細胞凋亡的相關分子機制卻鮮見報道。有研究顯示，PI3K/Akt信號通路在心肌細胞凋亡的發生發展中具有重要作用[10]。本研究結果表明，模擬失重96 h可致心肌細胞的凋亡基因及蛋白表達增加；同時對細胞凋亡有重要調控作用的轉錄因子GATA-4表達顯著降低，而轉錄因子MEF2A表達顯著增加；提示模擬失重96 h所致心肌細胞凋亡顯著增加可能存在轉錄水平的調控機制。

GATA結合蛋白家族廣泛存在于動植物和真菌、線蟲等體內，是調節細胞生長與分化的重要轉錄因子。GATA-4是調控心臟基因表達的重要轉錄因子，參與了心臟正常發育、功能基因表達和心肌肥大的病理過程，還在心肌重塑過程中發揮重要的調控作用[11]。實驗證明，過表達GATA-4能使體外培養的大鼠心肌細胞表面積增大，肌小節增生，胞內總蛋白積累顯著增多；而過表達GATA-4的成年轉基因小鼠可檢測到心肌肥厚相關基因如ANF和內皮素等的激活[12]。除了調控細胞的生長以及分化外，GATA-4還在細胞凋亡的調控中起重要作用[13]。研究發現，GATA-4活性的降低可致大鼠心肌細胞出現凋亡，而恢復GATA-4活性水平可減弱凋亡水平。近期也有研究發現，GATA-4通過調節bcl-2的激活而決定細胞是凋亡還是存活[14]。GATA-4對抗凋亡蛋白bcl-2具有重要調節作用，在體外培養的心肌細胞中，過表達GATA-4可提高bcl-2的基礎表達，而特異性抑制GATA-4的表達，bcl-2的表達水平則大幅度降低。

MEF2屬于轉錄因子MADS-box家族，由一個MADS結構域和N端MEF2特定結構域組成。脊椎動物的MEF2基因家族共有四個成員：MEF2A，MEF2B，MEF2C，MEF2D，分別定位于不同的染色體上。MEF2A蛋白定位于15q26染色體上，由507個氨基酸組成。MEF2的突出功能是控制肌細胞分化過程中的基因轉錄，維持心肌細胞構造的完整和保持適當的線粒體容量。MEF2蛋白在細胞的信號轉導、增殖以及生存與凋亡中發揮重要作用。研究表明，MEF2的轉錄活性在維持線粒體功能活性中起重要作用，抑制MEF2的活性可以導致心肌細胞出現線粒體功能降低，活性氧簇超量表達及細胞凋亡的增加[15]。已有研究證實，MEF2家族成員可與GATA-4直接相互作用激活下游基因的表達，GATA4通過其C末端的鋅指結構域與MEF2蛋白的DNA結合結構域直接作用，形成GATA4-MEF2復合體[16]。這說明GATA-4和MEF2A之間有一定聯系，可能通過協同作用共同參與調節成年心肌細胞的凋亡和存活。本研究結果表明，模擬失重96 h可致心肌細胞轉錄因子MEF2A基因及蛋白水平表達降低，與GATA-4的表達趨勢一致。

總之，本研究發現，回轉器模擬失重96 h可引起體外培養的心肌細胞出現凋亡增加，心肌細胞轉錄因子GATA-4和MEF2A表達降低可能在模擬失重所致的心肌細胞凋亡過程中起重要作用。轉錄因子如何調控心肌細胞凋亡，對它們的干預是否能防止心肌細胞凋亡，將是我們下一步研究的內容。

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