WWOX和 P53在非小細胞肺癌組織中的表達及意義

王鳳玲,張廣萍,張亞玲,孫云暉

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

WWOX基因是由 Bednarek等在2000年發(fā)現(xiàn)的一個新的脆性位點(CFSs)基因。有研究指出,WWOX蛋白主要位于線粒體。WWOX受多種凋亡應(yīng)激因素影響,其作用可造成線粒體通透性改變,WWOX蛋白合成增加,同時這些凋亡應(yīng)激因素還能使得 WW結(jié)構(gòu)域中的 Try33磷酸化,WWOX蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)位[2],上調(diào) P53,下調(diào) Bcl-2、Bcl-xl,增強 TRADD介導的細胞死亡及 TN F介導的細胞毒性。由此可知 WWOX基因可作為一種促凋亡蛋白發(fā)揮作用,它與 P53共同發(fā)揮作用,且在介導凋亡的過程中能產(chǎn)生協(xié)同作用,二者是介導細胞凋亡的配偶體。

國內(nèi)外文獻報道食管癌,鼻炎癌,卵巢癌,胃癌等的腫瘤中均有 WWOX及 P53的表達,但在肺癌組織中的表達報道較少,故本課題應(yīng)用免疫組化方法檢測 WWOX及 P53在非小細胞肺癌中的表達,通過探討其在肺癌中的表達情況,為肺癌診斷、治療、判斷預后提供有意義的生物學指標。

1 材料與方法

1.1 標本來源

實驗組:取佳大附屬第一醫(yī)院胸心外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為肺癌的病理標本40例,所有患者術(shù)前均未接受化療、放療和其他治療。臨床分期采用美國癌癥分類委員會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2002年制定的 TNM分期。

對照組:取同組病例距癌組織邊緣5cm以上的正常肺組織作為對照組。

1.2 試劑

①兔抗人 WWOX多克隆抗體;②兔抗人 P53單克隆抗體;③即用型 UltraSensitiveTM S-P試劑盒濃縮型;④ DAB試劑盒;⑤磷酸鹽緩沖液 PBS(0.01mol/L,pH7.2～7.4)粉劑。試劑均購自美國美國 Santa Cruz公司。

1.3 實驗方法

肺癌標本經(jīng)固定、常規(guī)石蠟包埋后切片,供常規(guī) HE染色和免疫組織化學染色。WWOX工作液配比濃度為1：150,P53工作液配比濃度為1：100。各步驟嚴格按照檢測試劑盒說明進行。

1.4 結(jié)果判斷標準

兩種蛋白染色陽性均為黃色至棕黃色顆粒,WWOX陽性表達定位于細胞胞質(zhì) ,P53定位于細胞核。P53的判斷標準:觀察10個高倍視野(10×40)內(nèi)細胞計數(shù),視野內(nèi)陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)在25%以下者為陰性,介于25%～50%為弱陽性,50%以上為強陽性。WWOX的判斷標準:①按染色強度計分:無著色為0分,淡黃色為1分 ,棕黃色為 2分。②按陽性細胞百分比計分:著色細胞 ＜10%為 0分,10%～39%為 1分,40%～69%為 2分,＞70%為3分。③將兩者相加總計分:0分為陰性,1～ 3分為弱陽性,4分以上為強陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件,采用i2檢驗,等級分析采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗,P ＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 WWOX蛋白在 NSCLC組織和正常肺組織中的表達

WWOX在實驗組中失表達者為 30例 ,失表達率為75%,在對照組中失表達者為20例,失表達率為 50%,WWOX在實驗組中的失表達率顯著高于對照組 (P＜0.05)。

2.2 P53蛋白在 N SCLC組織和正常肺組織中的表達情況

P53在實驗組中陽性表達為23例 ,陽性表達率 57.5%,在對照組中陽性表達為8例,陽性表達率為 20%,P53在實驗組中的陽性表達率顯著高于對照組 (P＜0.01)。

表1 WWOX基因的表達與各臨床病理因素的關(guān)系

表2 P53的表達與各臨床病理因素的關(guān)系

2.3 WWOX蛋白和 P53蛋白在 NSCLC組織中的表達與NSCLC各臨床病理因素的關(guān)系

WWOX的表達與病理類型、細胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＜0.05)。P53的表達與組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān) (P ＜ 0.05)。 (見表 1～2)

2.4 WWOX及 P53在 N SCLC中表達的相關(guān)性分析

WWOX與 P53表達負相關(guān),兩組相關(guān)系數(shù)為-0.49。(見表 3,圖 1)

表3 WWOX及 P53在 N SCLC中表達的相關(guān)性分析

圖1 WWOX陽性表達、陰性表達與 P53陽性表達的關(guān)系

3 討論

通過我們的實驗發(fā)現(xiàn) WWOX的表達缺失與非小細胞肺癌有關(guān),癌旁正常組織中 WWOX的失表達率明顯低于NSCLC中 WWOX蛋白的失表達率,因此我們認為 WWOX蛋白有可能參與調(diào)控肺癌的發(fā)生發(fā)展。

近年來人們對 P53的結(jié)構(gòu)及功能進行了更深入的探討,隨著越來越多的實驗研究及臨床研究,人們對這種基因有了更深刻的了解,突變型的 P53[3]具有抑制細胞凋亡的特性,且其性質(zhì)穩(wěn)定,易被免疫組化方法檢出,故常被應(yīng)用于各種實驗研究。本實驗也選用了突變型 P53作為檢測指標,實驗證明在 40例 NSCLC組織中,23例癌細胞 P53呈陽性表達 ,此外本實驗還發(fā)現(xiàn),P53的表達與組織分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

WWOX對 P53的作用可表現(xiàn)為結(jié)合穩(wěn)定性 P53,WWOX作用于 P53可以控制 P53的活性、結(jié)構(gòu)的變化、核轉(zhuǎn)錄等,抑制凋亡的發(fā)生,我們的實驗的結(jié)果顯示 WWOX、P53均與組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),也進一步證實了這一點,因此本次實驗結(jié)果顯示了 WWOX蛋白與 P53蛋白可作為肺癌的診斷和判斷預后的重要依據(jù)。但以上二種基因之間相互作用的具體機制有待于進一步研究。

[1]Bednarek AK,Laflin KJ,Daniel RL,et al.WWOX,a nov el WW domain-containing protein mapping to human chromosome16q23.3-24.1,aregion frequently affected in breast cancer[J].Cancer Res,2000,60:2140-2145

[2]Ludes-Meyers JH,Bednarek AK,Popescu NC,et al.WWOX,the common chromosomal fra-gile site,FRA16D,Cancer Gene[J].Cytogenetic Genome Res,2003,100(1-4):101-110

[3]Tokino T,Nakamura Y.The role of p53-target genes in human cancer[J].Oncology/Hematology,2000,33(1):1-6