細胞外基質磷酸糖蛋白對細胞增殖能力的影響

劉 爽,劉占領,張淑紅,張 輝,侯 杰,羅 蘭,魏 巍

(佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 154007)

細胞外基質磷酸糖蛋白 (matrixextracellular phosphoglyc oprotein,MEPE)最早由 Rowe等從骨骼惡性腫瘤的 cDN A文庫中發現[1]。MEPE蛋白是小型 N端連接整合素家族蛋白(small integrin-binding ligand N-linked Glycoproteins,SBLIN G)成員,因其某些特異保守區域與SBLING家族蛋白高度同源,例如 MEPE的C端一段酸性富含絲氨酸-天冬氨酸 MEPE相關基序(acidic serineaspartate-rich MEPE-associated moti,f ASARM motif),該序列是 SBLIN G家族蛋白的共同特征。且 MEPE與SBLING家族蛋白都定位于4號染色體長臂特定區域(4q21.1),形成基因簇,參與基質鈣化及調節成骨細胞與破骨細胞功能[2,3]。隨著研究的深入,發現 MEPE的功能遠超出最初對 MEPE蛋白的理解,其功能包括如調節骨牙代謝、參與細胞 DN A損傷應答、凋亡調節及腫瘤的發生發展。本文檢測MEPE蛋白對細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株及載體

細胞株與質粒 MEPE cDN A質粒由美國 EMORY大學王亞教授饋贈。293T細胞株購自上海中國科學院細胞研究所。質粒 pLEGFP-N 1為 BD Biosciences Clontech公司產品,大腸桿菌 E.coli DH5 T由本室保存。

1.2 主要試劑

PCR產物純化采用 BIO101公司提供的 Geneclean I I試劑盒(Cat# 1001-400);質粒提取采用 Qiagen公司QIAprep質粒提取試劑盒;限制性內切酶及 T4DN A連接酶購自 Takara生物公司。

1.3 PCR擴增、表達質粒的構建及序列測定

由質粒上擴增出 MEPE cDN A全長,所用擴增引物為:上游引 物:5′-CATATGAAGC TGAATGAAGAT-3′,下游引 物:3′-GGATCCTTA CAT TTGGGGGAGATG-3′,PCR擴增的目的基因經 N de I與 BamH I雙酶切后 ,克隆到經過同樣酶切處理的 pLEGFP-N 1載體上,得到融合表達質粒,轉化感受態大腸桿菌 DH5 T挑取單克隆進行 PCR篩選,選1～2個陽性克隆進行測序,鑒定序列及讀碼框架是否正確。

1.4 穩定轉染細胞株構建

在細胞生長狀態良好,融合率達90%～95%時進行轉染。按照 Lipofectamin2000操作手冊轉染六孔板內細胞。轉染48h后消化、重懸細胞,10倍稀釋后鋪 96孔板,每孔分別加入800_g/mL G418完全培養基進行克隆篩選,4周后選擇陽性細胞克隆進行鑒定、擴增培養凍存。

1.5 MT T檢測增殖能力

將生長密度達80%的293T細胞,常規胰酶消化、計數,以5×103密度的細胞200_L接種于96孔板。目的基因組、空載體組 ,每組3個復孔。置于 37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞培養1、3、5及 7d后,每孔吸出100_L培養基后每孔再加入10_L MTT(5mg/mL),培養箱中繼續孵育。4h后,吸去孔內液體,每孔加入200_L二甲基亞砜溶解沉淀。選擇490nm波長,在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度值并記錄結果。

1.6 RT-PCR檢測

按照北京華大蛋白質研發中心有限公司總 RN A提取試劑的說明書 ,用 Trizol提取細胞總 RN A。所用的實驗器具使用前均需用 DEPC水浸泡過夜,去除 RN A酶。RT-PCR檢測轉染細胞中 p53基因的表達。p53引物上游:

2 結果

2.1 穩定轉染細胞株檢測結果

提取穩定轉染細胞株總 RN A,進行 RT-PCR,電泳結果顯示兩組細胞87bp左右均可見 GAPDH擴增條帶出現;轉染目的基因細胞在110bp處見擴增條帶;空載體組在110bp處無擴增條帶出現,證明轉染成功,細胞可用于后續試驗。見圖1。

圖1 pLEGFP-N 1-mepe轉染細胞及 pLEGFP-N 1轉染細胞RT-PCR電泳圖

1:DL 500DN Amarker;2-3:轉染目的基因及空載體細胞中 GAPDH表達;4:轉染 M EPE質粒細胞中 MEPE表達;5:轉染 EGFP細胞中MEPE表達。

2.2 MT T檢測細胞增殖結果

MEPE轉染細胞和 EGFP空載體轉染組細胞鋪96孔板,并分別于 1d、3d、5d、7d用 MTT法測細胞增殖。從統計結果可知轉染 MEPE的293T細胞其增殖指數是轉染EGFP空載體組細胞增殖指數的1.30倍。見表 1,圖2。

圖2 M TT法檢測293T轉染 MEPE及 EGFP細胞增殖結果

表1 MTT法檢測 MEPE及 EGFP空載體轉染293T細胞增殖指數 (±s)

表1 MTT法檢測 MEPE及 EGFP空載體轉染293T細胞增殖指數 (±s)

組別 實驗分組(d)1 3 5 7 EGFP 組 0.11± 0.01 0.35± 0.13 0.65± 0.03 1.24± 0.12 M EPE組 0.39± 0.06 0.67± 0.08 1.62± 0.18 2.21± 0.28 t 6.17 3.59 7.29 4.53 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 RT-PCR檢測增殖與遷移相關因子表達情況

p53基因高表達細胞可表現出黏附、增殖、遷移侵襲等方面的生物學行為,實驗通過實時熒光定量 PCR,檢測轉染MEPE蛋白與轉染空載體細胞中三種基因的表達,從 PCR產物電泳圖及實時熒光擴增曲線兩方面比較三種基因在兩種細胞中的不同表達。

圖3 轉染 M EPE及空載體細胞中 p53基因表達

1.DL 500DN Amarker;2.轉染 M EPE細胞中 p53表達;3.轉染空載體細胞中 p53表達;4.DL 500DN Amarker;5.轉染 MEPE細胞中GAPDH表達;6.轉染空載體細胞中 GAPDH表達。

3 討論

MEPE是小型 N端連接整合素家族蛋白成員,近幾年來,越來越多的報道顯示 SIBL IN G家族成員與腫瘤發展的各個階段包括增殖、侵襲、轉移、血管生成相關。Lee JL等[4]人發現骨橋蛋白(OPN)與細胞表面受體蛋白 CD44相結合,可以使結腸癌 HT29細胞加速增殖并提高轉移潛能。Sharp JA等[5]人發現骨唾液蛋白(BSP)可以在體外促進乳腺癌MDA-MB231細胞增殖 ,轉染 IBSP基因的乳腺癌細胞注射裸鼠后腫瘤形成速度加快。Khodavirdi AC等[6]人在兩株前列腺癌細胞中提高OPN蛋白的表達水平,發現OPN有增加細胞侵襲的能力,在小鼠成瘤模型中觀察到高表達OPN的前列腺癌細胞侵入血管的能力增強。對大量的實驗結果分析,我們可以發現 SIBLIN G蛋白家族成員在許多腫瘤細胞中高表達,作為可溶性分泌性蛋白因子主要分布在細胞基質中,通過與細胞表面受體蛋白 CD44、整合素受體、金屬蛋白酶相互作用參與調節細胞信號傳導,在腫瘤細胞的黏附性、趨化性、抗凋亡、侵襲、遷移、不依賴支持物生長等惡性生物學特性中具有重要作用,并與腫瘤轉移以及預后不良相關。

在 SBLIN G家族中對于 MEPE在腫瘤發生發展中所起到的作用研究較少,與其他家族成員在結構上高度同源的MEPE是否也對腫瘤細胞的增殖侵襲有影響,需要進一步實驗驗證。近年來研究表明,許多腫瘤在發展過程中伴有MEPE蛋白的高表達,而且發現這些高表達 MEPE蛋白的腫瘤同時也表現出高的轉移傾向,且其抗電離輻射等抵抗DN A損傷誘導能力與 MEPE蛋白的表達量呈正相關。本實驗結果證明提高 MEPE蛋白表達水平可影響細胞增殖等生物學特性,并進一步證實其作用機制是通過 P53蛋白信號通路實現的。因此臨床檢測 MEPE表達可對惡性腫瘤的發生、轉移做出預測,為惡性腫瘤基因治療奠定基礎。而且檢測MEPE的表達水平還可監測腫瘤治療的預后,為腫瘤基因基因治療提供新的靶點。雖然目前基因治療尚未臨床普及,但其具有良好的潛在應用前景,在人類攻克癌癥,提高腫瘤患者生存率及生活質量上有望發揮重要作用。

[1]Rowe PS,De Zoysa PA,Dong R,et al.MEPE,a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia[J].G enomics,2000,67(1):54-68

[2]Bellahcene A,Castronovo V,Ogbureke K E,et al.Small integrinbinding N-linked Glycoproteins(SIBILIN G s):multifunctional protein in cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,8(3):212-226

[3]Fisher LW,Fedarko N S.Six genes expressed in bones and teeth encode the current members of the SIBLIN G family of proteins[J].Connect Tissue Res,2009,44(Suppl 1):33-40

[4]Lee J L.Osteopontin promotes integrin activation through outside-in and inside-out mechanisms:OPN-CD44V interaction enhances survival in gastrointestinal cancer cells[J].Cancer Res,2007,67:2089-2097

[5]Zhiyong Mi,Hongtao Guo and Paul C Kuo.Identif ication of osteopontin-dependent signaling pathways in a mouse model of human breast cancer[J].BMC Research Notes,2009,2:119-127

[6]Sharp J A,Waltham M,Williams ED,et al.Transfection of MDA-MB- 231 human breast carcinoma cells with bone sialoprotein(BSP)stimulates migration and invasion in vitro and growth of primary and secondary tumors in nude mice[J].Clin Exp Metastasis,2004,21:19-29