SHP－2和轉化生長因子β在中老年患者宮頸鱗癌組織中的表達

宋 利

(沈陽醫學院奉天醫院婦產科，遼寧 沈陽 110024)

腫瘤的發生與信號轉導密切相關〔1〕。蛋白酪氨酸磷酸酶是一種經典的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶，在信號轉導過程中起關鍵作用，并在許多生理調節過程中也具有重要作用，其主要通過調節細胞內酪氨酸的磷酸化水平來調控細胞的生長、增殖、分化、代謝、遷移、適應、防御、基因轉錄和凋亡等〔2〕。目前有證據表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B與腫瘤具有相關性〔3〕。SHP-2是一種非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，其介導的信號轉導異常與多種疾病包括腫瘤的發生和發展密切相關〔4〕。大量研究提示，轉化生長因子β(TGF-β)可能參與了宮頸癌的發生與發展〔5～7〕。而 SHP-1/2 能夠調節 TGF-β 介導的信號分子(如src kinases)的活性〔8，9〕，基于此，課題組假設 SHP-2 在宮頸癌的形成和發展中發揮著重要的作用。本實驗采用分子生物學技術從蛋白和基因水平觀察正常宮頸、宮頸上皮內腫瘤(CIN)和宮頸鱗癌組織中SHP-2和TGF-β的表達。

1 資料與方法

1.1 標本來源 納入2009年7月至2012年4月在沈陽醫學院奉天醫院婦產科住院治療的患者。其中宮頸鱗癌患者120例，年齡45～72歲，平均(43±5)歲;CIN患者80例，年齡42～72歲，平均(45±4)歲;宮頸正常患者30例，年齡43～67歲，平均(42±3)歲。所有患者在取材前均未經任何治療，均經病理診斷證實，排除宮頸腺癌患者。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色檢測宮頸組織SHP-2和TGF-β的表達取宮頸組織，10%甲醛固定后，脫水，浸蠟，包埋，行4μm厚連續切片，切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后微波修復抗原;3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶;在兔抗SHP-2和TGF-β多克隆抗體(1∶500;Santa Cruz公司)中4℃孵育過夜;生物素標記的羊抗兔IgG中孵育2 h(37℃);DAB顯色，顯微鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌終止反應，蘇木精復染，自來水沖洗，返藍;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。每例標本隨機取3個視野(100倍)，應用 Image-Pro Plus圖像分析軟件測量 SHP-2和TGF-β的IOD，取平均值。

1.2.2 實時RT-PCR檢測宮頸癌組織SHP-2 mRNA的表達按Trizol試劑說明提取各組宮頸標本組織細胞總RNA，并檢測RNA完整性和純度，利用cDNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成 cDNA。根據 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)的人SHP-2 mRNA序列，以primer5.0設計其上、下游引物序列。SHP2:上游:5'-GGA GGG CGG GAG GAA CAT GAC ATC-3'，下游:5'-GGG AGA GGG TGA AAG TCC ACA TCT AT-3';β-actin:上游 5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3'，下游:5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3'。利用特異引物和PCR擴增試劑盒分別合成SHP-2和β-actin基因。PCR反應條件:94℃，預變性 5 min。94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸1 min，共40個循環。72℃延伸10 min。應用 Rotor-Gene 3000熒光實時定量PCR儀(香港基因有限公司)的Comparative Delta-delta Ct法對獲得的熒光曲線結果進行分析，以同一樣品目的基因擴增產物和內參β-actin的擴增產物的比值確定目的基因的表達水平。

1.2.3 Western印跡法檢測宮頸癌組織SHP-2蛋白的表達分別取各組宮頸標本組織，用細胞裂解液提取蛋白，Bradford方法測蛋白濃度;調節蛋白濃度一致，取等量蛋白樣品，行SDSPAGE電泳分離蛋白，然后用半干式電轉的方法將蛋白質轉移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白37℃封閉2 h，1∶200的兔抗SHP-2單克隆抗體中4℃孵育過夜;生物素標記的羊抗兔IgG中37℃孵育2 h，DAB顯色，見有清晰條帶出現即用雙蒸水終止顯色。所得圖像用掃描儀掃描，應用北京航天航空大學CM-2000B型生物醫學圖像分析系統測量條帶的吸光度值，將目的蛋白吸光度值與GAPDH的比值作為結果。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行分析，結果用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織TGF-β的表達 免疫組化染色結果顯示在正常宮頸組織僅有個別標本中可見TGF-β的表達，顯示出弱的棕黃色，主要集中在胞質;CIN標本中TGF-β陽性表達的數量較正常宮頸標本多，但染色依舊較弱;宮頸鱗癌組織TGF-β陽性標本數目明顯增多，染色也相對較深，見圖1。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件對所有標本TGF-β的IOD值進行測量，結果顯示在正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織，TGF-β的表達分別為(0.934 ±0.652)，(2.673 ±0.638)，(3.784±0.538)，三者間兩兩比較差異顯著(P＜0.05)。

圖1 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織TGF-β的表達(免疫組化染色，×100)

2.2 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2的分布與表達免疫組化染色結果顯示SHP-2的表達以胞質染色陽性為主，也有少許胞核染色陽性，見圖2。與正常宮頸組織比較，CIN及宮頸鱗癌組織中SHP-2的表達明顯增高(P＜0.05)，且宮頸鱗癌組織中SHP-2的表達明顯高于CIN(P＜0.05)，見表1。

2.3 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2 mRNA的表達宮頸鱗癌組織中SHP-2 mRNA表達最高，其次是CIN，在正常宮頸中表達最低，見表1。

圖2 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2的表達(免疫組化染色，×100)

表1 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2蛋白及mRNA的表達(x±s)

2.4 正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2蛋白的表達Western印跡可見，在正常宮頸組織中幾乎看不到SHP-2蛋白的表達，而在宮頸鱗癌組織中SHP-2蛋白條帶較深，表達最多，CIN組織中的SHP-2蛋白條帶介于正常宮頸和宮頸鱗癌組織之間，見圖3，三者間兩兩比較差異顯著(P＜0.05)，見表1。

圖3 Western印跡檢測正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織SHP-2的表達

3 討論

SHP-2是一種由PTPNII基因編碼的廣泛分布在胞漿中的蛋白酪氨酸磷酸酶，含有2個SH結構域和1個催化功能結構域。其作為細胞因子、生長因子及其他胞外刺激因素的下游信號分子參與了細胞的增殖、分化、死亡等過程〔10〕。同時一些研究發現，其與一些癌癥密切相關。然而趙碩〔11〕對癌癥組織中SHP-2 mRNA水平進行檢測并未發現SHP-2在癌癥組織及正常組織中表達明顯差異，發現了與其同源性較高的pseudo基因的差異表達。但也有研究顯示〔12〕，在人體幾種主要器官，包括肺癌、胃癌、卵巢癌、直腸癌、乳腺癌、結腸癌等的正常和癌變組織中，SHP-2在蛋白和mRNA水平上均產生了差異表達。且研究發現其在一些惡性腫瘤中高度活化，可能與癌癥的發生離不開信號轉導改變有關。而SHP-2在從細胞表面到細胞核的信號傳導通路中扮演重要角色，主要包括JAK-STAT途徑、Ras-MAPK途徑及PI3K途徑。而且SHP-2通過對細胞內磷酸化的酪氨酸殘基去磷酸化調節細胞的增殖與分化，而異常的增殖和分化正是腫瘤細胞的特征之一。

本研究發現SHP-2在宮頸鱗癌組織中表達最高，CIN組織次之，正常宮頸組織中表達最低，與孟斐〔13〕測得的SHP-2在宮頸癌患者血清中SHP-2的表達升高相一致。提示SHP-2參與了宮頸癌的發生，且與癌癥的分型密切相關。SHP-2的過度表達參與了宮頸癌的發生。

TGF-β是功能復雜的細胞因子，具有調節細胞生長、分化、血管形成、細胞凋亡等多種功能，還參與細胞外基質的重建、間質細胞的產生和機體抗腫瘤免疫等，因此其與很多腫瘤的發生、發展有密切關系〔14，15〕。本實驗發現 TGF-β1在宮頸鱗癌組織中表達最高，CIN組織次之，正常宮頸中表達最低，驗證了TGF-β在宮頸癌形成中的作用。

總之，本實驗從蛋白和基因水平證實了SHP-2在宮頸鱗癌組織高表達，可能參與了宮頸癌的形成及分型，并發現了SHP-2和TGF-β在宮頸癌組織中表達具有一致性，但具體的作用機制及信號調節通路還有待進一步研究。

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12 王德利.SHP2在正常與癌變組織中表達差異的研究〔D〕.長春:吉林大學，2007.

13 孟 斐.宮頸病變患者SHP-2與CD4+T表達意義的研究〔J〕.當代醫學，2010;16(31):46-7.

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