石墨爐原子吸收光譜法測定細胞中微量金屬元素鐵、銅、錳的含量

丁 沖,謝 麗,商 澎

(西北工業(yè)大學生命學院空間生物實驗模擬技術國防重點學科實驗室,陜西西安710072)

石墨爐原子吸收光譜法測定細胞中微量金屬元素鐵、銅、錳的含量

丁 沖,謝 麗,商 澎

(西北工業(yè)大學生命學院空間生物實驗模擬技術國防重點學科實驗室,陜西西安710072)

采用石墨爐原子吸收光譜法進行細胞中微量金屬元素鐵、銅、錳含量的測定。分別針對貼壁培養(yǎng)的成骨細胞MC3T3-E1和懸浮培養(yǎng)的白血病細胞K562進行量化分析,依據(jù)細胞總數(shù)和細胞內(nèi)總蛋白含量進行歸一化處理,所得結(jié)果與文獻報道具有較好的一致性。該方法靈敏度高,重復性好,適用于培養(yǎng)細胞中鐵、銅、錳等微量金屬元素的定量測定,為微量金屬元素在細胞中的作用以及細胞組分研究提供實驗依據(jù)。

石墨爐原子吸收光譜法;微量金屬元素;成骨細胞;白血病細胞

化學元素在細胞生命活動中的作用以及與癌癥的關系一直受到研究者的關注,其檢測在臨床診斷中也具有重要的作用。研究顯示鐵元素在體內(nèi)的含量與直腸癌等多種癌癥的發(fā)生呈現(xiàn)正相關[1];銅過量時會導致細胞產(chǎn)生氧化損傷;在癌癥轉(zhuǎn)移的動物模型中觀察到錳超氧化物歧化酶的表達增加[2]。

生物樣品中金屬元素含量非常低,由于在體外常規(guī)培養(yǎng)的細胞中數(shù)量有限導致對培養(yǎng)細胞內(nèi)金屬元素含量的檢測更加困難,如鐵和銅在人結(jié)腸癌細胞HT-29中的含量分別為10～20 ng·(106cells)-1和4～8 ng·(106cells)-1[3]。另外,樣品處理過程中易發(fā)生交叉污染等,導致微量金屬元素的定量檢測成為具有挑戰(zhàn)性的任務。基于樣品量少、高靈敏度的要求,全反射X-射線光譜法、流動注射電感藕合等離子體質(zhì)譜法和石墨爐原子吸收光譜法(GF-AAS)已成功用于培養(yǎng)細胞中微量金屬元素的檢測分析[4],在實際檢測中根據(jù)檢測元素和樣品的不同可選擇不同方法。

作者以貼壁培養(yǎng)的成骨細胞MC3T3-E1和懸浮培養(yǎng)的白血病細胞K562為研究對象,采用準確、穩(wěn)定的GF-AAS方法檢測兩種細胞內(nèi)微量金屬元素鐵、銅、錳的含量,再分別進行細胞計數(shù)和總蛋白測定,定量描述細胞內(nèi)的元素含量,擬為相關研究提供依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1(澳大利亞悉尼大學周虹教授惠贈);人白血病細胞K562(第四軍醫(yī)大學生物技術中心惠贈)。

α-MEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、FBS血清,美國Hyclone公司;胰蛋白酶,美國Amresco公司;1000μg ·m L-1鐵、銅、錳標準溶液,國藥集團化學試劑有限公司;硝酸、氯化鈉,優(yōu)級純,西隴化工股份有限公司; BCA蛋白測試試劑盒,美國Thermo Scientific公司;實驗用水為超純水(18.2 MΩ)。

ZEEnit700P型原子吸收光譜儀,德國Analytik Jena公司;CO2培養(yǎng)箱,德國Heraeus公司;CKX41型倒置顯微鏡,日本Olympus公司;Biofuge Stratos型臺式高速冷凍離心機,美國Thermo Scientific公司; Synergy HT型多功能酶標儀,美國Bio-Tek公司;Vicell XR型全自動活細胞分析儀,美國Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1培養(yǎng)采用添加10%FBS的α-MEM基本培養(yǎng)基。人白血病細胞K562培養(yǎng)采用添加10%FBS的1640基本培養(yǎng)基。

1.2.2 樣品制備

1.2.2.1 小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1

取一定數(shù)量對數(shù)生長期的細胞,棄上清;用胰酶消化細胞,并用生理鹽水洗細胞3次,800 r·min-1離心10 min,棄洗液;第3次洗滌時記錄細胞懸浮液體積,混勻后取出1 m L用于細胞計數(shù);同時取200μL置于1.5 m L離心管中,于15 000 g、4℃離心15 min后棄上清,加入40μL細胞裂解液,室溫放置10 min后, -20℃保存用于總蛋白檢測;剩余細胞懸浮液于15 000 g、4℃離心15 min后取出,棄上清,加入40μL純硝酸,混勻,60℃孵育2 h,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 人白血病細胞K562

取一定數(shù)量對數(shù)生長期的細胞,混勻收集到離心管內(nèi),800 r·min-1離心10 min,棄上清;用生理鹽水洗細胞3次,800 r·min-1離心10 min,棄洗液;第3次洗滌時記錄細胞懸浮液體積,混勻后取出1 m L用于細胞計數(shù);同時取200μL置于1.5 m L離心管中,于15 000 g、4℃離心15 min后棄上清,加入40μL細胞裂解液,室溫放置10 min后,-20℃保存用于總蛋白檢測;剩余細胞懸浮液于15 000 g、4℃離心15 min后取出,棄上清,加入40μL純硝酸,混勻,60℃孵育2 h,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 原子吸收光譜儀的工作參數(shù)(表1)

表1 原子吸收光譜儀的工作參數(shù)Tab.1 Working parameters of atomic absorption spectrometer

1.2.4 原子吸收光譜儀的石墨爐參數(shù)(表2)

1.2.5 細胞中微量金屬元素含量的測定

將備用樣品溶解后加入9960μL超純水將硝酸濃度降為4‰,混勻后用石墨爐原子吸收光譜法測定消解細胞樣品中鐵、銅、錳元素含量,每個樣本重復檢測3次。

1.2.6 細胞計數(shù)和總蛋白的測定

將用于細胞計數(shù)的樣品混勻,分別采用血球計數(shù)板和全自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù),每個樣本重復計數(shù)3次。細胞總蛋白的測定采用BCA法,按照BCA蛋白測試試劑盒的步驟進行,每個樣本重復測試3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線方程

將1000μg·m L-1鐵、銅、錳元素標準溶液用4‰HNO3依次梯度稀釋至濃度為50 ng·m L-1、50 ng· m L-1、10 ng·m L-1。原子吸收光譜儀自動將各元素的標準品按5個濃度梯度等差稀釋后進樣,繪制標準曲線并擬合數(shù)據(jù),其回歸方程見表3。

表2 原子吸收光譜儀的石墨爐參數(shù)Tab.2 Graphite furnace parameters of atomic absorption spectrometer

表3 鐵、銅、錳元素的標準曲線回歸方程Tab.3 The regression equations of standard curves for elements Fe,Cu and Mn

2.2 細胞中鐵、銅、錳元素的含量

按1.2.5方法測得的是所檢測樣品的原始元素含量,不能定量反映細胞中該元素的含量。依據(jù)1.2.6方法測得的細胞數(shù)目和細胞總蛋白含量進行歸一化處理,分別得出每個細胞中鐵、銅、錳元素的含量以及單位質(zhì)量細胞中各元素的含量,結(jié)果見表4。

2.3 細胞中鐵、銅、錳元素的加標回收率

采用標準加入法,在制備的備用樣品中加入鐵、銅、錳元素的標準品20 ng·m L-1、10 ng·m L-1、2 ng·m L-1,在選定參數(shù)條件下采用石墨爐原子吸收光譜法測定加標后樣本的鐵、銅、錳元素含量,計算平均回收率。結(jié)果表明,鐵、銅、錳元素的加標回收率分別為102.5%、90.8%、105.7%,均符合相關要求。

表4 MC3T3-E1細胞和K562細胞內(nèi)鐵、銅、錳元素含量Tab.4 The contents of iron,copper and manganese in MC3T3-E1 cell and K562 cell

2.4 討論

將測得的MC3T3-E1細胞和K562細胞中鐵、銅、錳元素的含量與文獻報道的石墨爐原子吸收光譜法檢測的其它細胞中的含量進行比較,結(jié)果見表5[2,5]。

從表5可看出,所測的K562細胞內(nèi)鐵元素含量為58 fg·cell-1,與文獻報道的47.5 fg·cell-1基本一致;錳元素含量為0.073 fg·cell-1,與文獻報道的0.9 fg· cell-1稍有出入,這或與樣品前處理方法有關。

3 結(jié)論

采用石墨爐原子吸收光譜法測定了貼壁培養(yǎng)的成骨細胞MC3T3-E1和懸浮培養(yǎng)的白血病細胞K562中微量金屬元素鐵、銅、錳的含量,與文獻報道相比, K562細胞中鐵元素含量基本一致、錳元素含量偏低。該方法靈敏度高、重復性好,可用于培養(yǎng)細胞中鐵、銅、錳等微量金屬元素的定量測定,為微量金屬元素在細胞中的作用以及細胞自組分研究提供依據(jù)。

表5 文獻報道不同細胞中鐵、銅、錳元素的含量Tab.5 Literature survey on the intracellular content of iron,copper and manganese in different cell lines

[1] Huang X.Iron overload and its association with cancer risk in humans:Evidence for iron as a carcinogenic metal[J].Mutat Res, 2003,533(1-2):153-171.

[2] Jin X,Chalmers J J,Zborowski M.Iron transport in cancer cell culture suspensions measured by cell magnetophoresis[J].Anal Chem,2012,84(10):4520-4526.

[3] Szoboszlai N,Réti A,Budai B,et al.Direct elemental analysis of cancer cell lines by total reflection X-ray fluorescence[J].Spectrochim Acta B:Atomic Spectroscopy,2008,63(12):1480-1484.

[4] Szoboszlai N,Polgari Z,Mihucz V G,et al.Recent trends in total reflection X-ray fluorescence spectrometry for biological applications[J].Anal Chim Acta,2009,633(1):1-18.

[5] Polgari Z,Ajtony Z,Kregsamer P,et al.Microanalytical method development for Fe,Cu and Zn determination in colorectal cancer cells[J].Talanta,2011,85(4):1959-1965.

Determination of Contents of Trace Metal Elements Iron,Copper and Manganese in Cells by Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry

DING Chong,XIE Li,SHANG Peng
(Key Laboratory for Space Bioscience&Biotechnology,School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University,Xi'an 710072,China)

In this paper,the contents of trace metal elements iron,copper and manganese in cells were detected by graphite furnace atomic absorption spectrometry.For different cells including adhere-wall cultured osteoblast MC3T3-E1 and suspension cultured leukemia cell K562,the quantitative analysis was conducted by the normalization based on total number and total protein content respectively.The results showed good consistency with those of literature.In summary,this method was suitable for determination of the contents of Fe,Cu and Mn in the cultured cells with high sensitivity and good repeatability,and provided experimental basis for the research of the role of trace metal elements in cells as well as the cell components.

graphite furnace atomic absorption spectrometry;trace metal element;osteoblast;leukemia cell

O 657.31

A

1672-5425(2013)11-0071-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.11.019

國家自然科學基金資助項目(51147008),高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20126102110055)

2013-09-06

丁沖(1984-),女,陜西三原人,博士研究生,研究方向:生物電磁特性及磁場生物學效應,E-mail:dingchong@mail.nwpu.edu.cn;通訊作者:商澎,教授,E-mail:shangpeng@nwpu.edu.cn。