設計利用現(xiàn)代科學儀器 緊跟科學前沿的細胞生物學實驗

薛雅蓉，莊 重，劉智慧

（南京大學 生命科學學院，南京 210093）

2006年，國務院《國家中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃綱要（2006—2020年）》中提出，到2020年使我國進入創(chuàng)新型國家行列。胡錦濤同志在2012年的全國科技創(chuàng)新大會上又重述了這一目標。這都說明在我國的未來發(fā)展戰(zhàn)略中構建創(chuàng)新型國家的目標是勢在必行、勢在必得。

創(chuàng)新型國家建設需要創(chuàng)新型人才，而大學又是培養(yǎng)創(chuàng)新性人才的重要基地。在大學教育中，實踐／實驗教學是培養(yǎng)創(chuàng)新型人才的重要環(huán)節(jié)。很難想象陳舊的實驗教學內(nèi)容能夠培養(yǎng)出創(chuàng)新型人才。因此，需要廣大的實驗教師和科技工作者設計出緊跟科學前沿發(fā)展的新實驗教學項目，為創(chuàng)新人才培養(yǎng)奠定基礎。

科學儀器的發(fā)展能夠推動科學技術的發(fā)展，主要表現(xiàn)在拓寬了科學研究的領域，開拓了新的科學前沿［1］。科學儀器也是高校開展創(chuàng)新實驗必不可少的硬件條件，具有非常重要的作用。各個高校對這一點都已有明確的認識并在不斷改善實驗條件，使硬件條件不再成為限制開展創(chuàng)新型實驗的羈絆。但僅有科學儀器是不夠的，教師必需關注學科的最新進展，利用先進的科學儀器開展創(chuàng)新型實驗，將科學儀器真正轉(zhuǎn)變成輔助創(chuàng)新型實驗教學的工具。

細胞生物學與我國現(xiàn)代生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的五大重點領域（生物醫(yī)藥、生物農(nóng)業(yè)、生物能源、生物制造、生物環(huán)保）都有交集和關聯(lián)，該領域涉及的檢測技術是整個生物領域的基礎和重要組成部分，在高校相關專業(yè)學習的大學生是這個領域未來的中堅力量，了解和初步掌握這些前沿檢測儀器和手段對他們是十分必要的。這也是我們設計相關實驗、并與同行交流的初衷。

1 細胞生物學現(xiàn)代科學儀器及其在細胞生物學研究中的應用

用于細胞生物學研究的科學儀器很多，在這里只介紹目前比較先進的幾種科學儀器，而對常規(guī)細胞生物學儀器如普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡及與其他學科交叉應用較多的科學儀器，如電泳儀、電轉(zhuǎn)儀等不做介紹。

1.1 透射電子顯微鏡

在光學顯微鏡下無法看清小于0.2μm的細微結構，這些結構稱為亞顯微結構（submicroscopic structures）或超微結構（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清這些結構，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年，Ruska利用波長遠小于可見光及紫外光的電子波（100kV的電子波的波長為0.003 7nm，而紫外光的波長為400 nm）作為光源，發(fā)明了透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），以透過樣品的電子束來成像，使得細胞超微結構（各種細胞器結構）得以清楚觀察［2］。

1.2 激光掃描共聚焦顯微鏡

激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，簡稱LSCM）是20世紀80年代在熒光顯微鏡基礎上發(fā)明的新型生物醫(yī)學圖像儀器。第一臺商品化的共聚焦顯微鏡由美國Biorad（伯樂）公司于1984年推出。它使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，并在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置和計算機圖像處理系統(tǒng)，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結構和成分的熒光圖像［3－4］。

激光共聚焦顯微鏡在細胞生物學實驗中不可替代的用途包括：

（1）構建細胞三維圖像。LSCM在不損傷細胞的前提下，可產(chǎn)生組織細胞的光學切片，對活組織、活細胞不同層次進行觀察和測量，所測數(shù)據(jù)儲存于計算機中，經(jīng)計算機圖像處理三維重建軟件重組，可得到標本的三維立體結構，揭示亞細胞結構的空間關系。

（2）利用細胞器和細胞成分的熒光探針標記特定細胞器與細胞成分后，可利用激光共聚焦進行細胞器如線粒體、高爾基體，細胞成分如脂質(zhì)、蛋白、核酸、各種離子含量及存在部位的檢測、觀察。

（3）粘附細胞的直接分選。

1.3 流式細胞儀

流式細胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）是20世紀70年代發(fā)展起來的一種高科技細胞研究儀器，利用可見光或紫外光對通過儀器的細胞流進行檢測分析。主要用途可歸結為兩個大的方面［5］：

（1）細胞測量與分析：它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特征參量，如細胞大小、細胞周期、細胞DNA倍體含量、細胞凋亡情況、抗原表達。

（2）細胞分選：可以根據(jù)預選的細胞參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來［6］。

流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡都可對細胞內(nèi)熒光標記成分進行分析，但前者卻只能測定單細胞的總量，不能分辨其分布位置。后者即可測定其含量，又可觀察其分布。

2 幾個細胞生物學研究前沿領域

細胞生物學研究的前沿領域包括細胞衰老及抗衰老、腫瘤細胞誘導凋亡 、干細胞及腫瘤細胞的誘導分化 、細胞信號轉(zhuǎn)導 、細胞周期調(diào)控、細胞基因沉默等。

2.1 關于細胞衰老的研究

細胞衰老（cellular senescence）是一個應激導致細胞生長停滯的生理過程。細胞衰老及抗衰老研究一直是細胞生物學研究的熱點領域之一，研究主要集中在衰老機制、引起細胞衰老的因素以及控制細胞衰老的方法［7］。

美國科學家Denham Harman 1956年提出了衰老的自由基學說，認為生物體衰老過程中的退行性變化是由于細胞正常代謝過程中產(chǎn)生的自由基的有害作用造成的。體外利用過氧化氫誘導培養(yǎng)細胞發(fā)生衰老樣變化的實驗驗證了Harman的觀點。

無論從哪個角度研究衰老細胞，都需要首先對其進行識別和確定。現(xiàn)在最常用的方法為細胞衰老相關的β－半乳糖苷酶檢測［8］。這種β－半乳糖苷酶是一種與細胞代齡（即衰老程度）有關的酶，可在接近中性的條件下作用于其生色底物 X－gal（5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳 糖 苷，5－Bromo－4－Chloro 3－Indoly－（－D－Galactoside，X－gal）生成藍色不溶物。Dimiri（1995）提出將這種中性β－半乳糖苷酶作為體內(nèi)外細胞衰老研究的生物學標志，可在反應后用普通光學顯微鏡觀察研究。

有研究者用激光共聚焦顯微鏡觀察比較了正常和衰老的人二倍體成纖維細胞經(jīng)DAPI染色后的顯色差異，結果發(fā)現(xiàn)在衰老細胞核中出現(xiàn)呈點狀聚集的特征性異染色質(zhì)結構，被稱為衰老相關異染色質(zhì)灶（senescence－associated heterochromatinfoci，SAHF）［9］，該發(fā)現(xiàn)為識別衰老細胞提供了一個新的生物學標志。

2.2 關于腫瘤細胞誘導凋亡的研究

癌癥（cancer）是一種對人類健康甚至生命危害極大的疾病，是腫瘤細胞因增殖失控而大量增殖的結果。藥物抗癌是治療癌癥的重要途徑之一。其中通過干擾腫瘤細胞生長、代謝、增殖等過程并最終誘導腫瘤細胞凋亡是抗癌藥物治療的理想途徑。檢測細胞凋亡相關指標是了解藥物是否通過誘導凋亡機制抗癌、繼而尋找誘導凋亡的抗癌藥物的前提條件。

凋亡細胞在形態(tài)、細胞核、細胞膜、DNA完整性等方面都不同于正常細胞，比較典型的特征如細胞核染色質(zhì)凝集、邊緣化，細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，DNA從核小體處規(guī)律斷裂而使電泳呈梯狀條帶等。普通光學顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀及其他現(xiàn)代科學儀器在檢測細胞凋亡的這些現(xiàn)象中都可以發(fā)揮其各具特色的作用［10－11］。

2.3 干細胞及腫瘤細胞的誘導分化

細胞分化是指同一來源的細胞逐漸產(chǎn)生各自特有的形態(tài)結構、生理功能和生化特征的過程。關于細胞的誘導分化研究更多集中在誘導干細胞向所需細胞類型轉(zhuǎn)化，旨在為臨床移植治療及組織器官功能恢復治療奠定基礎［12－13］。

近年來細胞生物學領域一個倍受關注的課題是腫瘤細胞的誘導分化研究。其原理基于惡性腫瘤細胞與正常細胞的分化程度不同而導致生長及分裂速度不同，惡性腫瘤細胞為去分化細胞，生長及分裂速度遠大于正常細胞。誘導腫瘤細胞由去分化狀態(tài)恢復到分化狀態(tài)是惡性腫瘤治療的一個新途徑［14－15］。

被誘導分化的腫瘤細胞分裂速度減慢，可通過流式細胞儀準確檢測細胞分裂指數(shù)得以顯示誘導是否成功。

2.4 細胞信號轉(zhuǎn)導

細胞信號轉(zhuǎn)導是指細胞外信號分子作用于細胞受體（膜受體或胞內(nèi)受體）后引發(fā)細胞內(nèi)的一系列生物化學反應以及蛋白間相互作用，直至細胞生理反應所需基因開始表達、各種生物學效應形成的過程。與信號轉(zhuǎn)導有關的物質(zhì)包括受體、胞內(nèi)激酶、胞內(nèi)信使、轉(zhuǎn)錄因子等。調(diào)控這些物質(zhì)可以改變細胞的信號轉(zhuǎn)導過程，引起細胞興奮或抑制，從而改變細胞功能。檢測細胞內(nèi)第二信使含量變化及信號蛋白磷酸化水平是檢測信號轉(zhuǎn)導的主要方法［16］。激光共聚焦顯微鏡可以觀察胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，信號蛋白磷酸化水平可通過蛋白電泳后的 Western blot（蛋白質(zhì)印跡）方法分析。其中Western blot中所用一抗為磷酸化蛋白對應的抗體。

2.5 細胞周期調(diào)控

細胞周期（cell cycle）是指由細胞分裂產(chǎn)生新細胞的生長開始到下一次細胞分裂形成子細胞結束為止所經(jīng)歷的過程。

人為調(diào)控細胞周期，對于從理論上研究細胞周期的不同特點以及進行植物多倍體誘導［17］、抗腫瘤研究和臨床應用都有重要意義［18］。流式細胞儀在分析細胞周期方面非常有用［19］。

2.6 RNA干擾引起的細胞基因沉默

這主要指利用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）引起細胞特定基因轉(zhuǎn)錄后特異性不表達。通過特異性的沉默基因，可實現(xiàn)研究特定基因功能、調(diào)節(jié)細胞生長分化、封閉不良基因表達等［20－21］。RNA干擾引起的因基因沉默而表達蛋白水平下降通常通過蛋白電泳后的Western blot方法分析，如果是對細胞生長相關基因的沉默則可用流式細胞儀分析細胞周期的方法加以顯示。

3 利用現(xiàn)代科學儀器設計緊跟科學前沿的細胞生物學實驗

3.1 細胞衰老的誘導與觀察

用雙氧水誘導培養(yǎng)的293T細胞或其他細胞產(chǎn)生衰老變化，然后用X－gal染色并用普通顯微鏡觀察衰老相關的β－半乳糖苷酶活性的變化；或用DAPI（4’，6－diamidino－2－phenylindole），對正常腫瘤細胞與發(fā)生衰老變化的腫瘤細胞進行染色后再用共聚焦顯微鏡觀察染色質(zhì)著色特征的差異。

3.2 腫瘤細胞的誘導凋亡與檢測

用羥基喜樹堿等可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡變化的抗腫瘤藥物處理S－180腹水瘤細胞、Jurkat細胞，然后進行不同處理后用普通光學顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、電泳儀等檢測細胞發(fā)生的凋亡變化。

（1）普通光學顯微鏡觀察：制備細胞涂片，用瑞氏染液或吉姆薩（Giemsa）染液染色后在普通光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及染色質(zhì)的變化，以及是否形成凋亡小體等。

（2）電子顯微鏡觀察：制備細胞電鏡標本，進一步觀察染色質(zhì)的凝集及分布以及細胞超微結構的其他變化。

（3）激光共聚焦顯微鏡觀察：用 FITC－AnnexinV／PI對細胞進行雙染色，染色后的細胞標本用激光共聚焦顯微鏡觀察正常細胞、凋亡早期細胞、凋亡晚期細胞、壞死細胞的染色特征；

（4）流式細胞儀測定：用流式細胞儀將凋亡細胞、正常細胞、壞死細胞分開，統(tǒng)計凋亡細胞比率，檢測藥物誘導凋亡的效率。

（5）用電泳儀：提取細胞DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡細胞的特征DNA條帶，進一步證明細胞發(fā)生的凋亡變化。

3.3 骨髓造血干細胞的分離及誘導分化檢測

可利用細胞磁分選儀及流式細胞儀分離大鼠骨髓CD34＋造血干細胞，然后用IL－3、IL－6、干細胞因子等細胞因子體外刺激其增殖后再與乳鼠心肌細胞共培養(yǎng)，使CD34＋造血干細胞向心肌細胞分化，發(fā)生分化變化的細胞用普通光學顯微鏡即可觀察。

3.4 腫瘤細胞的誘導分化及檢測

維甲酸是一種腫瘤細胞誘導分化劑，可以在體內(nèi)及體外誘導腫瘤細胞由幼稚型向成熟細胞分化。因此，用含有維甲酸的細胞培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)HL－60（人早幼粒白血病細胞系）細胞，可使細胞群中的中幼粒和晚幼粒細胞比例增多、細胞增殖活性下降。細胞分類計數(shù)可通過細胞涂片、瑞氏染液染色后普通顯微鏡觀察得以實現(xiàn)；細胞增殖活性可用流式細胞儀檢測細胞分裂指數(shù)顯示。

3.5 細胞的激活及信號轉(zhuǎn)導分子檢測

鈣離子是重要的細胞內(nèi)第二信使，當胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高至一定濃度時，便與鈣調(diào)蛋白結合，進而影響和調(diào)節(jié)眾多細胞內(nèi)代謝活動。細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高也是淋巴細胞激活和增殖過程中早期呈現(xiàn)的一個重要現(xiàn)象。因此，可用PHA（植物血凝素）或ConA（刀豆蛋白A）激活淋巴細胞，然后用鈣離子熒光探針Fluo－3對細胞進行熒光染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察激活前后胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

3.6 細胞周期調(diào)控及檢測

細胞周期蛋白Cyclins對細胞增殖有正調(diào)控作用，這種作用尤以cyclin D1為代表。正常情況下，cyclin D1在G1期是恒定的，其過量表達可導致G1縮短，細胞分裂速度加快，導致細胞增殖失控，甚至形成癌變。用攜帶細胞周期蛋白D1的質(zhì)粒pRK5－CyclinD1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的293T細胞，然后收集細胞并用PI染色后可用流式細胞儀檢測分析細胞周期中G1期，S期和G2／M期各時相的百分比。

3.7 RNA干擾沉默癌基因及腫瘤細胞增殖檢測

c－myc是永生性癌基因，在細胞的生長、繁殖、凋亡及分化中具有極重要的地位。合成針對c－myc mRNA的第1545－1565靶位點的siRNA，然后轉(zhuǎn)染Jurkat細胞，72h后收集細胞并用PI染色后可用流式細胞儀檢測分析細胞周期中G1期，S期和G2／M期各時相的百分比，借此顯示對細胞增殖的抑制作用。

4 結束語

總之，利用現(xiàn)代科學儀器，針對細胞生物學學科發(fā)展前沿和熱點，開設大學細胞學創(chuàng)新型實驗，不僅有助于提升學生對現(xiàn)代科學儀器及其在細胞學中的應用的了解，掌握相關學科的基礎知識和實驗技能，而且有助于提高學生綜合應用現(xiàn)代儀器解決細胞學及其他相關學科的科學問題的能力。這種設計實驗的思路也有望為其他學科實驗、實踐教學環(huán)節(jié)開展創(chuàng)新型教學提供參考。

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