中藥提取工藝的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及數(shù)據(jù)處理方法

中藥及其復(fù)方的提取精制是中藥研究的關(guān)鍵技術(shù)之一，也是決定其藥效的最根本步驟。該項(xiàng)研究往往要通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和數(shù)據(jù)處理來完成。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和數(shù)據(jù)處理方法的選擇直接關(guān)系到工藝優(yōu)選結(jié)果的可行性及可靠性。本文就中藥提取分離工藝優(yōu)選中常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法作一概述，并舉例說明它們在中藥提取工藝中的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1．1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(One－factor experimental design) 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)又稱控制變量法［1］，每次實(shí)驗(yàn)只控制單一變量，而其他因素相對固定。在提取工藝優(yōu)化過程中，常需同時(shí)考察多個(gè)因素對結(jié)果的影響，并對結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。采用固定其他因素改變某一因素的單因素考察法能收到一定效果，但條件優(yōu)選憑經(jīng)驗(yàn)，且無法考察各因素間的相互作用。因此，該方法現(xiàn)一般用于預(yù)實(shí)驗(yàn)，少有單獨(dú)用于提取工藝優(yōu)選的。楊萬政等［2］用單因素實(shí)驗(yàn)法，以綠原酸、牛蒡子苷及總黃酮得率為指標(biāo)，對溶媒、醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和浸泡時(shí)間等6因素進(jìn)行考察，優(yōu)選了清喉顆粒的提取工藝。

1．2 正交設(shè)計(jì)(orthogonal design) 當(dāng)因素水平數(shù)較多時(shí)，需采用實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法。正交設(shè)計(jì)是按照正交表和相應(yīng)的交互表進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，是多因素多水平實(shí)驗(yàn)的效率很高的設(shè)計(jì)方法。它是由試驗(yàn)因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進(jìn)行試驗(yàn)的，通過對這部分試驗(yàn)結(jié)果的分析了解全面實(shí)驗(yàn)的情況，找出最優(yōu)的水平組合。正交設(shè)計(jì)保留了析因設(shè)計(jì)整體考慮、綜合比較的優(yōu)點(diǎn)，避免了析因設(shè)計(jì)的全面實(shí)驗(yàn)、工作量大的弊病［3］。但必須強(qiáng)調(diào)的是，均勻分散和整齊可比是正交設(shè)計(jì)的本質(zhì)特征。因此，在應(yīng)用該方法時(shí)，首先應(yīng)注意所設(shè)的因素水平是否均勻分散和整齊可比，否則其后的數(shù)據(jù)分析幾乎沒有任何意義?；谶@點(diǎn)，沈群［4］指出“提取次數(shù)”不能作為正交設(shè)計(jì)的考察因素。

正交設(shè)計(jì)目前在我國中藥提取工藝研究過程中最為常用。何迅等［5］采用L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以大黃素、多糖類、咖啡酸等指標(biāo)成分的動(dòng)態(tài)變化為評價(jià)指標(biāo)，對各工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，篩選了蒲薏顆粒的最佳醇水雙提工藝。傅亮等［6］采用正交設(shè)計(jì)法研究了四逆泡騰片中干姜油的提取及其β－環(huán)糊精包合的最佳工藝。揮發(fā)油提取工藝考察因素為加水倍量、浸泡時(shí)間、蒸餾時(shí)間，考察指標(biāo)為揮發(fā)油提取量。童榮生等［7］通過正交實(shí)驗(yàn)，以小檗堿、巴馬汀、黃芩苷、黃芩素的含量為評價(jià)指標(biāo)，考察了加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間對半夏瀉心湯水提醇沉工藝的影響。郝偉偉等［8］采用單因素結(jié)合正交設(shè)計(jì)法，優(yōu)選出65%乙醇溶液為提取溶媒，進(jìn)一步考察了微波功率、微波輻射時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)及料液比4個(gè)因素，用紫外－可見分光光度法測定烏頭總生物堿，采用HPLC法測定芍藥苷，并以其量及浸膏得率作為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選了微波法提取制川烏配伍白芍中有效成分烏頭總生物堿和芍藥苷的工藝條件。

1．3 均勻設(shè)計(jì)(uniform design) 均勻設(shè)計(jì)最早由我國數(shù)學(xué)家方開泰和王元在1978年共同提出，它的基本思路就是盡量使實(shí)驗(yàn)點(diǎn)充分均勻分散，使每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)具有更好的代表性，但同時(shí)舍棄了正交設(shè)計(jì)中對因素水平“整齊可比”的要求，以減少試驗(yàn)次數(shù);然后根據(jù)多元統(tǒng)計(jì)方法來彌補(bǔ)這一缺陷，使實(shí)驗(yàn)結(jié)論同樣可靠。它的突出優(yōu)點(diǎn)是使多因素多水平實(shí)驗(yàn)的次數(shù)大大減少，一般當(dāng)因素較多且水平數(shù)≥5時(shí)，可以考慮均勻設(shè)計(jì)［3］。

均勻設(shè)計(jì)首先在我國飛航式導(dǎo)彈的設(shè)計(jì)中得到有效的應(yīng)用。近年來，在中藥制劑提取工藝的應(yīng)用逐漸增多［9］。陳新民等［10］運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)并結(jié)合定量指紋圖技術(shù)優(yōu)化了丹黃凝膠醇提工藝參數(shù)。采用HPLC指紋圖譜技術(shù)，按U8(82×42)均勻設(shè)計(jì)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取次數(shù)和提取時(shí)間4個(gè)因素，以大黃酚和小檗堿含量、HPLC指紋圖譜特征峰總面積之和以及干浸膏得率為綜合評價(jià)指標(biāo)，采用多元非線性擬合，建立效應(yīng)指標(biāo)和考察因素之間的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)最佳數(shù)學(xué)模型描繪效應(yīng)面圖和等高線圖，確定醇提工藝參數(shù)的優(yōu)化范圍及最佳工藝條件。王秀文等［11］采用均勻設(shè)計(jì)法考察微波功率、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)4個(gè)因素對黨參、茯苓混合水溶性多糖含量的影響，優(yōu)選微波法提取的適宜條件。陳麗等［12］采用堿溶酸沉與超聲波相結(jié)合的方法提取柿葉總黃酮，并以柿葉總黃酮含量為評價(jià)指標(biāo)，用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選提取工藝。艾慶波等［13］為確定超臨界萃取京萬紅的最適宜工藝參數(shù)，通過U12(12×6×6)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，考察壓力、溫度和夾帶劑乙醇濃度的影響，以超臨界提取物的出膏率、β，β－二甲基丙烯酰阿卡寧及異歐前胡素含量為指標(biāo)，采用多因素分析來確定最適宜工藝參數(shù)。

1．4 星點(diǎn)設(shè)計(jì) －效應(yīng)面法(central composite design－response surface methodology，CCD－RSM) 當(dāng)因素水平數(shù)較多時(shí)，國內(nèi)常用均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，但這兩種方法具有實(shí)驗(yàn)精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性較差等缺點(diǎn)。近年來國外常用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的效應(yīng)面優(yōu)化法(response surface methodology，RSM)進(jìn)行優(yōu)化［14］，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用單因素設(shè)計(jì)及均勻設(shè)計(jì)的都有［15，16］，但采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)的較多。

RSM主要考察自變量對效應(yīng)的作用并對其進(jìn)行優(yōu)化。它通過描繪效應(yīng)對考察因素的效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而回推出自變量取值范圍即最佳實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化法。但必須注意的是，RSM中的自變量必須連續(xù)且可被實(shí)驗(yàn)者準(zhǔn)確控制［17］。對于考察因素是非連續(xù)的自變量時(shí)，不能使用效應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)分析。

CCD設(shè)計(jì)是多因素五水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，是在二水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加上極值點(diǎn)和中心點(diǎn)構(gòu)成的。通常實(shí)驗(yàn)表是以代碼的形式編排的，實(shí)驗(yàn)時(shí)再轉(zhuǎn)化為實(shí)際操作值，一般水平取值為0，±1，±α，其中0為中值，α 為極值，α =(F)1/4，F(xiàn)為析因設(shè)計(jì)部分實(shí)驗(yàn)次數(shù)，F(xiàn)=2k(k為因素?cái)?shù))或F=2k×1/2(一般5因素以上采用)CCD［14］。星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法比正交實(shí)驗(yàn)法更簡化，比均勻設(shè)計(jì)法更全面，其試驗(yàn)次數(shù)較少，試驗(yàn)精度高，并適用于多因素、多水平的實(shí)驗(yàn)。該設(shè)計(jì)法最大的優(yōu)點(diǎn)是可對未做過的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測，但同時(shí)須有豐富的專業(yè)知識(shí)和一定的預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定各因素的范圍［18］。該方法越來越多被應(yīng)用于中藥提取工藝優(yōu)選。郜新蓮等［19］采用星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以丹皮酚產(chǎn)量為指標(biāo)，以加水量、浸泡時(shí)間和蒸餾液體積為考察因素，采用design expert7．05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對牡丹皮中丹皮酚的提取工藝參數(shù)進(jìn)行了預(yù)測分析和優(yōu)化。楊濤等［20］以乙醇濃度、提取時(shí)間和溶媒比為自變量，以穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的收率和浸膏得率為因變量，通過對自變量的總評歸一值進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化穿心蓮的超聲提取工藝條件。陸剛等［21］通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化酶解參數(shù)，并利用多元線性回歸和多項(xiàng)式回歸建立預(yù)測模型，優(yōu)選出丹參須根有效成分的酶法提取工藝。王秋紅等［22］以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溶媒比為自變量，以升麻總皂苷得率為因變量，通過對自變量各水平的多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合，用效應(yīng)面法優(yōu)選升麻中總皂苷的提取工藝最佳工藝，同時(shí)進(jìn)行了預(yù)測分析。

2 數(shù)據(jù)處理方法

2．1 方差分析(analysis of variance，ANOVA) 方差分析由英國統(tǒng)計(jì)學(xué)家Fisher首創(chuàng)，為紀(jì)念Fisher，以F命名，故方差分析又稱F檢驗(yàn)(F test)［23］。它是在可比較的數(shù)組中，把數(shù)據(jù)間的總的“變差”按各指定的變差來源進(jìn)行分解的一種技術(shù)。對變差的度量，采用離差平方和，方差分析方法就是從總離差平方和分解出可追溯到指定來源的部分離差平方和。它能根據(jù)數(shù)據(jù)分析找出對該事物有顯著影響的因素，各因素之間的交互作用，以及顯著影響因素的最佳水平等。方差分析在中藥提取精制工藝的研究中應(yīng)用非常廣泛，主要用在正交設(shè)計(jì)的結(jié)果處理中［5－8］。

2．2 回歸分析(regression analysis) 回歸分析所研究的主要問題就是如何利用變量X，Y的觀察值(樣本)，對回歸函數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷，包括對它進(jìn)行估計(jì)及檢驗(yàn)與它有關(guān)的假設(shè)等?；貧w分析可以理解為用一種確定的函數(shù)關(guān)系去近似代替比較復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系，這個(gè)函數(shù)稱為回歸函數(shù)，在實(shí)際問題中稱為經(jīng)驗(yàn)公式?；貧w分析在藥學(xué)的研究領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值，其在中藥提取工藝優(yōu)化等方面的正交設(shè)計(jì)分析、均勻設(shè)計(jì)分析方法及星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面優(yōu)化法的結(jié)果處理中均有廣泛的應(yīng)用［10－22］。王新春等［24］通過正交實(shí)驗(yàn)，用比色法測定有效成分的含量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)不同的計(jì)算和分析比較優(yōu)選大黃的提取工藝條件。結(jié)果數(shù)據(jù)不同的處理方式得到不同的優(yōu)化工藝條件，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，用多元線性回歸計(jì)算，可彌補(bǔ)正交極差方差計(jì)算的不足，更有利于結(jié)果解釋和工藝條件的優(yōu)化。

2．3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network，ANN) 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為一種聚類分析和模式識(shí)別方法，是基于模擬大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能而建立的一種信息處理系統(tǒng)和理論化的數(shù)學(xué)模型，具有能夠進(jìn)行復(fù)雜的邏輯操作和非線性表達(dá)能力強(qiáng)大等優(yōu)點(diǎn)。中藥有效成分提取分離是非常復(fù)雜的過程，傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)和方法難于精確反映其多因素多水平的復(fù)雜非線性關(guān)系，而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，經(jīng)過有限次迭代計(jì)算而獲得的一個(gè)反映實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)內(nèi)在規(guī)律的數(shù)學(xué)模型，特別適合于研究復(fù)雜非線性系統(tǒng)的特性［25］。劉紅梅等［26］以莪術(shù)醇含量為響應(yīng)指標(biāo)，用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法優(yōu)化莪術(shù)有效成分的超臨界CO2萃取工藝。得出莪術(shù)的超臨界CO2最佳萃取工藝，測試樣本的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值和實(shí)際測量值的相對誤差＜4%。優(yōu)化的萃取工藝比常規(guī)最小二乘法的優(yōu)化結(jié)果優(yōu)越。楊銘等［27］采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，并結(jié)合遺傳算法獲得了丹參最佳提取工藝，實(shí)現(xiàn)了BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法對丹參提取工藝的多目標(biāo)優(yōu)化。此外，他們還以同樣的方法，優(yōu)化了秦皮的提取工藝［28］。朱俊訪等［29］利用蔥白提取工藝均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，建立神經(jīng)模型，結(jié)合遺傳算法對網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行優(yōu)化，并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果表明優(yōu)化后的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有較高的預(yù)測精度。綜上所述，可見每種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法都有其特點(diǎn)和適用范圍，不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，其適用的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)的計(jì)算方法和統(tǒng)計(jì)分析方法也會(huì)不同。因此，科研工作者應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，進(jìn)行全面的統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)，選擇最適合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，才能使研究結(jié)果更科學(xué)、更真實(shí)可靠。在實(shí)際的應(yīng)用中，常常將各種統(tǒng)計(jì)方法聯(lián)合應(yīng)用，這樣可以更加圓滿地解決問題。隨著統(tǒng)計(jì)學(xué)、藥學(xué)、數(shù)學(xué)及應(yīng)用軟件的快速發(fā)展，統(tǒng)計(jì)學(xué)在中藥提取工藝研究方面將做出更為突出的貢獻(xiàn)。

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