高分子聚乙烯顆粒負荷對體外培養(yǎng)滑膜細胞的影響研究

龐顯倫

(瀘州醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生所 四川 瀘州 646000)

研究表明，磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解受多種因素影響，包括磨損顆粒的種類、形態(tài)及大小［1］。研究已經(jīng)證明:磨損顆粒負荷下，成骨細胞影響假體，導(dǎo)致松動原因之一，其機制不完全明確。那么促使成骨細胞產(chǎn)生這些生物學(xué)行為的細胞和分子機制究竟是怎樣的?滑膜作為關(guān)節(jié)內(nèi)重要的免疫器官在假體松動中又扮演著怎樣的角色?目前有少量研究發(fā)現(xiàn)用生物陶瓷涂層假體的磨損顆粒負荷體外培養(yǎng)的滑膜細胞，可同樣誘導(dǎo)滑膜細胞產(chǎn)生TNF － α［2］。要搞清楚上述問題，有必要先搞清楚高分子聚乙烯顆粒負荷對體外培養(yǎng)滑膜細胞的影響。本文旨在討論此問題。

資料與方法

1. 細胞準備:滑膜細胞的培養(yǎng)采用組織培養(yǎng)法分離培養(yǎng)，參照文獻［2］。無菌條件下，用含雙抗的1 × PBS 液反復(fù)沖洗滑膜組織。將組織剪成約2 mm × 2 mm × 2 mm 的小塊，均勻鋪置于培養(yǎng)瓶中。向培養(yǎng)瓶中加入含10% FBS 的高糖DMEM 液，在5% CO2和37 ℃的孵育箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。每3 天換液1 次，待細胞爬移出組織并生長至90% 左右融合狀態(tài)時，胰酶消化1∶3 傳代。反復(fù)傳代貼壁培養(yǎng)以去除其中混雜的細胞，選用第4 代的滑膜細胞進行實驗。

2. 高分子聚乙烯顆粒為德國Hoechst 公司產(chǎn)品，光鏡測量，顆粒長徑(78. 5021 ± 3. 3572)μm，短徑(55. 6250 ± 3. 0463)μm。日立S － 800 掃描電鏡下觀察顆粒的外形。

3. 方法

(1)分組:傳至普通培養(yǎng)瓶的細胞隨機分為2 組，分為試驗組和對照組，兩組于傳代后第二天先分別隨機取出2 瓶，行細胞計數(shù)。同時1 組在無菌條件下于培養(yǎng)瓶內(nèi)加入高分子聚乙烯顆粒，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。此后每天每組各隨機取出2 瓶，輕搖使死亡細胞浮起后，棄培養(yǎng)液，作細胞計數(shù)，取均值分別繪制生長曲線并計算倍增時間。

(2)步驟:傳至含蓋玻片條青霉素瓶的細胞隨機分為2 組，每組10 瓶，其中1 組作空白對照，另1 組在傳代后第二天無菌操作下加入高分子聚乙烯顆粒懸液50 μl，混均后繼續(xù)培養(yǎng)。兩組于處理后1、3、9、12、24、48 h 分別隨機抽出2 瓶，將瓶內(nèi)蓋玻片條取出。其中一片用10% 中性甲醛固定48 h，普通HE 染色，作組織學(xué)觀察;另一片立即用臺盼藍染色2 min，在蒸餾水中漂洗2次后鏡檢，取10 個視野分別計100 個細胞中的著色細胞數(shù)。

4. 統(tǒng)計分析:求均值得出各處理組在不同時點的死亡細胞數(shù)，t 檢驗作統(tǒng)計學(xué)處理。

結(jié) 果

1. 滑膜細胞生長特性:體外培養(yǎng)的滑膜細胞在加入高分子聚乙烯顆粒后表現(xiàn)出不同的生長特性。高分子聚乙烯顆粒浮于液面，細胞生長不僅未受影響，反略強于空白對照組，倍增時間為22. 8h，而后者為26. 3 h。

2. 高分子聚乙烯顆粒組:滑膜細胞生長旺盛，超過空白對照組，死亡細胞少見。兩種顆粒濃度對細胞生長特性的影響無明顯差別。

討 論

假體周圍骨溶解導(dǎo)致的無菌性松動是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最常見的遠期失敗主要原因之一。目前對人工關(guān)節(jié)無菌性松動的具體發(fā)生機制尚不完全清楚，可能是由多種因素，如磨損顆粒、微動、應(yīng)力遮擋、高液體壓力等因素引起。其中，磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解被認為是造成假體無菌性松動的主要原因。關(guān)節(jié)置換術(shù)后，假體與周圍骨質(zhì)或骨水泥與周圍骨質(zhì)之間存在微動或不可避免的磨損，導(dǎo)致假體周圍釋放出大量的磨損顆粒。由于持續(xù)存在的磨損顆粒對成骨細胞、巨噬細胞等的潛在影響，使其對內(nèi)置物的使用壽命起著關(guān)鍵的作用。因此，認識磨損顆粒在假體無菌性松動過程中的影響及機理，對于尋找防治無菌性松動的方法，提高人工關(guān)節(jié)置換術(shù)遠期固定效果和內(nèi)置物壽命有著重要的意義。所以，要深入研究上述問題，就需要建立滑膜細胞與磨損顆粒之間的作用機理模型。

高分子聚乙烯磨損顆粒在人工關(guān)節(jié)無菌性松動過程中起重要作用，對界面細胞的具有生物學(xué)效應(yīng)［3］。在非細胞毒性劑量上，聚合物顆粒比骨水泥顆粒更能刺激致炎因子的釋放，刺激滑膜細胞的增生，抑制骨形成，刺激破骨細胞源性骨吸收。

本研究發(fā)現(xiàn)高分子聚乙烯顆粒促進體外滑膜細胞的增值，而滑膜細胞在關(guān)節(jié)假體松動及導(dǎo)致疼痛的機制中發(fā)揮作用，所以不難看出，高分子聚乙烯顆粒通過物理及化學(xué)的作用加速假體松動的速度，但是不是始動因素，還需要做相關(guān)研究。

1 Wang ml，Sharkey PF，Tuan RS. Particle bioreactivity and wear － mediated osteolysis ［J］. J Arthroplasty. 2004;19(8):1028 － 1038.

2 Wang Y，Yang L，Zhang J，et al. Differential MMP － 2 activity induced by mechanical compression and inflammatory factors in human synoviocytes ［J］. Mol Cell Biomech. 2010;7(2):105 － 114.

3 Bendall SP，Gaies M，F(xiàn)rondoza C，et al. Effect of particulate bioactive glass on human synoviocyte cultures ［J］. J Biomed Mater Res. 1998;41(3):392 － 397.