乙肝患者治療前后檢測HBV抗原蛋白特異性T細胞的反應

劉紅娟

湖南省岳陽市愛康醫院檢驗科 414000

我國乙肝病毒攜帶者眾多，研究乙肝治療的方法有著重要的現實意義，抗病毒治療乙肝是當前治療乙肝的主要手段，有報道稱，乙肝患者的特異性細胞免疫被得到抑制，但是，此方面研究并不是很多，所以，我院對60例乙肝患者展開研究，在治療前后，監測乙肝患者的HBV抗原蛋白特異性T細胞的變化，具體報道如下。

資料與方法

一般資料:我院從2012年1月～2013年1月隨機選擇60例慢性乙型肝炎患者，男性患者27例，女性患者33例，年齡區間34～61歲，平均年齡42.21歲。通過診斷，所有患者均符合乙肝診斷標準。對照組為接種乙肝疫苗的健康人20例，男性12例，女性8例，年齡區間32～62歲，平均年齡43.29歲，抗 ～HBe、抗 ～HBc、HBsAg、HBeAg均為陰性，抗～HBs陽性。兩組研究對象在性別、年齡、體重、身高等方面均無統計學差異(P＞0.05)。

治療方法:50例慢性乙肝患者進行抗病毒治療，其中使用干擾素治療的患者有28例，核苷酸類似物治療患者22例。對照組健康人不參與治療。

檢測方法:①使用ELISA方法檢測血清標志物HBVM，選用上海復星長征生物技術有限公司生產的試劑，并且嚴格按照操作流程檢測。②使用PCR檢測HBV～DNA，檢測技術為多聚酶鏈反應PCR，依然選用上海復星長征生物技術有限公司生產的檢測試劑。陽性標準為HBV～DNA病毒數≥103copies/ml，陰性標準為HBV－DNA病毒數＜103copies/ml。③抗原特異性T細胞免疫應答:常規復蘇PBMC的方法。事先準備包被有IFγ－1單克隆抗體的96孔，讓后將5×103個細胞/孔將細胞放置其中。設置陽性陰性對照孔及實驗孔，并設置兩個復孔。陽性對照孔加入刺激物植物凝血素PHA，最終濃度是0.2μg/L;陰性對照孔不加入刺激物;實驗孔加入 HBcAg、HBsAg、HBeAg，濃度是 5μg/L。并在5%CO和37℃下孵育24小時。第2天將細胞丟棄，并使用濃度為0.05%Tween20的PBS進行6次洗板并拍干。放入PBS稀釋生物素化的IFN－1多克隆抗體(1:1000)，在放置在溫室里3小時后，再6次洗板。將顯色液加入，直到陽性對照孔出現的斑點較深且大小適宜時顯色停止。棄掉顯色液并洗板2次后風干。使用ELISPOT讀板儀讀板，陽性反應為陰性對照孔2倍以上。

統計學方法:使用SPSS10.0軟件進行數據分析，資料計數為±s，使用t對數據間的差異進行檢測，資料數據顯示比率為百分率，使用X2比較組間差異性，若P＜0.05視為其差異有統計學意義。

結 果

患者治療前的所有HBV－DNA＞104拷貝/ml數據，經過3個月后，有51例患者的HBV－DNA水平降至正常范圍以內。詳細數據，見表1和表2。

表1 治療前HBV特異性抗原蛋白的反應頻率

表2 治療前后HBV－DNA變化

討 論

目前研究認為，慢性乙肝患者完全喪失出現HBV特異性T細胞的功能障礙，但具體機制尚不非常明確。對慢性乙肝患者進行外周血檢測中能夠檢測到乙肝病毒特異性CD8+細胞，并且同HBV～DNA濃度成反比例變化［1］。

研究中發現，患者治療前通過對HBV抗原蛋白進行刺激，結果在HBcAg、HBsAg、HBeAg方面均無反應，或者只產生一種或兩種反應，并且強度一般，這說明患者機體已經無法通過自身抗體清除病毒，所以，HBV特異性T細胞反應對于檢測慢性乙肝治療效果有著重要的作用。能夠作為檢測乙肝治療效果的重要指標。

1 Fislcaro P，Va/dattac，Bonl C，et al.Early kineticsofinnate and adaptive immune responses during hepatitis B vJtus infection Gut，2009，58(7):974082.