動物抗菌肽基因工程表達(dá)研究進(jìn)展

徐 敏，余 娟，賀會利，陳明艷，魏小兵，陳玲麗，胡建和，劉興友

（河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院 動物病毒防控與藥殘分析河南省重點學(xué)科開放實驗室農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全系統(tǒng)控制河南省高校教育部重點實驗室培育基地動物疫病和殘留防控河南省高校工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng)453003）

抗菌肽是一種具有廣譜抗菌活性的多肽，它也是動物防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性肽類物質(zhì)。一般由20～60個氨基酸殘基組成，分子量在2 000～7 000Da左右。抗菌肽合成的速度非常快，肽鍵合成速度比IgM快100多倍［1－2］，致使機(jī)體在受到損傷或者病原微生物入侵時能迅速產(chǎn)生抗菌肽殺傷入侵者。所以抗菌肽又被稱為是機(jī)體理想的第一道防線。自從20世紀(jì)70年代首先由瑞典的科學(xué)家Boman H G在用大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶分離到第一個真正意義上的抗菌肽－天蠶素（cecropin）以來，此后人們相繼又在兩棲類、昆蟲、水產(chǎn)動物及包括人在內(nèi)的哺乳動物甚至植物及細(xì)菌等廣泛的生物譜中發(fā)現(xiàn)了1 700余種抗菌肽［3］。多數(shù)抗菌肽具有優(yōu)良的廣譜抗菌性能，對于革蘭陽性菌和陰性菌都表現(xiàn)出良好的抑菌和抗菌效果；抗菌機(jī)理不同于抗生素，對真核細(xì)胞幾乎沒有作用，僅作用于原核細(xì)胞，同時不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性；并且對于一些真菌、病毒、原蟲和腫瘤細(xì)胞都有一定的殺傷作用，相對于抗生素具有效價高、無殘留等特點，因此一直受到各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，抗菌肽在體外克隆和轉(zhuǎn)載表達(dá)等研究也得到很好的發(fā)展，各種轉(zhuǎn)抗菌肽基因動植物及其產(chǎn)品相繼問世，為抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)利用提供一條廣闊的道路。因此如何更好的開發(fā)利用好抗菌肽這一資源，使之為人類健康服務(wù)，已受到越來越多的重視。

天然抗菌肽在生物體中含量較低，所以從生物體內(nèi)直接分離提取的難度大；而化學(xué)合成的抗菌肽表現(xiàn)出與天然抗菌肽一致的生物活性，但對技術(shù)和成本的要求高，不宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，限制了其應(yīng)用；抗菌肽的來源成為制約其發(fā)展的關(guān)鍵。基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，極大促進(jìn)了抗菌肽的開發(fā)和研究，利用基因工程方法異源表達(dá)抗菌肽是一種相對較經(jīng)濟(jì)的方法。人們在利用原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng)制備抗菌肽的過程中進(jìn)行了種種嘗試，取得了許多進(jìn)展。本文主要對抗菌肽在大腸桿菌、桿狀病毒和畢赤酵母表達(dá)體系的研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述，以期為其規(guī)模化生產(chǎn)利用提供參考和借鑒。

1 動物抗菌肽在大腸桿菌中的表達(dá)

大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)是迄今在基因工程領(lǐng)域中研究應(yīng)用最多、最完善的原核表達(dá)系統(tǒng)。而該系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于抗菌肽表達(dá)的是pGEX系列和pET系列的表達(dá)載體，用兩者進(jìn)行基因工程表達(dá)均具有操作簡單、培養(yǎng)成本低、周期短等特點。pGEX系列的表達(dá)載體提供的是GST標(biāo)簽，可以增加目的蛋白的溶解度，容易表達(dá)形成可溶的GST融合蛋白，便于親和層析快速純化，能維持目的蛋白的高級結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，融合的GST可選用因子Xa或凝血酶去除，使目的蛋白容易切下來，但缺點是可溶性蛋白易受細(xì)菌內(nèi)蛋白酶的作用而降解；pET系列的表達(dá)載體在原核蛋白表達(dá)中應(yīng)用最多，具有許多同樣的限制性酶切位點，還能提供不同的融合標(biāo)簽如His·Tag標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、T7·Tag標(biāo)簽及表達(dá)系統(tǒng)配置，能夠應(yīng)用于不同類型的異源蛋白表達(dá)。

Moon等［4］以pGEX－4T－3為載體，在大腸桿菌BL21中以與GST融合的方式表達(dá)了具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的37個氨基酸殘基的人殺微生物肽（humancathelicidin）LL－37，目標(biāo)蛋白用因子Xa切割下來，再用RP－HPLC進(jìn)行純化，最后獲得了0.3mg/L的產(chǎn)量，可以滿足針對該蛋白結(jié)構(gòu)等方面的基礎(chǔ)研究。趙曉宇等［5］通過人工合成的方法獲得抗菌肽Lactoferricin B基因的優(yōu)化序列，并將其成功構(gòu)建到pGEX－4T－2表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta（DE3）宿主菌中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果表明Lactoferricin B在大腸桿菌中的表達(dá)量超過20%以上，表達(dá)的蛋白多為可溶性形式，并對金黃色葡萄球菌具有明顯抑菌活性，為人們使用基因工程技術(shù)制備抗菌肽LfcinB提供了具有重要參考價值的技術(shù)路線和理論依據(jù)。王慶豐等［6］根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計合成鯰魚抗菌肽Parasin I，成功克隆到pGEX－4T－1中，以大腸桿菌BL21為工程菌進(jìn)行表達(dá)，純化后的融合蛋白對革蘭陽性的金黃色葡萄球菌有抑菌作用，為進(jìn)一步研究Parasin I及其相關(guān)抗菌肽抗菌、抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。Chen等［7］從蠶幼蟲中擴(kuò)增出Cecropin A成熟肽基因，并將其成功構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體pET－32a（＋）上，與表達(dá)載體中的Thioredoxin基因構(gòu)成融合基因，最后經(jīng)異丙基－β－D硫代半乳糖苷誘導(dǎo)，可表達(dá)Cecropin A成熟肽，說明使用該表達(dá)系統(tǒng)可以獲得天然Cecropin A成熟肽。付登峰［8］將類牛源LNK－16抗菌肽三串聯(lián)成功地構(gòu)建到表達(dá)載體pET－30a（＋）中，通過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為37℃、IPTG濃度0.5mmol/L誘導(dǎo)10h，其表達(dá)量占菌體總蛋白的32.6%，并且以包涵體的形式存在，結(jié)果顯示純化后的表達(dá)產(chǎn)物對大腸桿菌有抑菌活性。劉誠等［9］將抗菌肽 Dermadistinctin－K 成 功 地 構(gòu) 建 到 pET－32a（＋）中，并通過微量稀釋法測定經(jīng)過腸激酶酶切的融合蛋白對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌、炭疽桿菌均具有抑菌活性，而未經(jīng)腸激酶酶切的融合蛋白未表現(xiàn)出抑菌活性。胡功鈴等［10］成功將雜合抗菌肽HMCM基因克隆到的大腸桿菌表達(dá)載體pET－32a－c（＋）中，并在大腸桿菌 BL21（DE3）中獲得成功表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)EK酶酶切后對枯草芽孢桿菌有明顯的抑菌作用，而對大腸桿菌則沒有抑菌作用。Luo等［11－12］將Plectasin抗菌肽的編碼序列優(yōu)化，成功地克隆到表達(dá)載體pET－32a（＋）中，最后以Trx－融合蛋白形式獲得表達(dá)，切割Trx－tag標(biāo)簽后，檢測結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌有抗菌活性。

無論哪種原核表達(dá)載體都還存在一些避免不了的缺點，如不能對表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾，對重組蛋白的活性會有一定的影響。另外，在某些情況下，大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)可能會形成不溶性的包涵體，必須經(jīng)過變性、復(fù)性等繁瑣的操作處理后才能應(yīng)用。大腸桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素也難以除去，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難。為了克服上述缺點，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入到真核基因調(diào)控領(lǐng)域中。

2 動物抗菌肽在桿狀病毒中的表達(dá)

近幾年出現(xiàn)的適用范圍廣、表達(dá)效率高的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也是抗菌肽基因工程表達(dá)系統(tǒng)中一種重要的表達(dá)體系。桿狀病毒中用于表達(dá)抗菌肽的表達(dá)系統(tǒng)主要是利用Bac－To－Bac桿狀病毒系統(tǒng)，使用這個系統(tǒng)產(chǎn)生的重組桿狀病毒與使用同源重組產(chǎn)生重組桿狀病毒所需要的4周～6周相比，鑒別純化重組病毒少于2周；同時減少了從斑點篩選重組病毒DNA所包含親緣和非重組病毒的幾率；并且能夠快速進(jìn)行大量重組；適合表達(dá)一些功能性研究的蛋白。

Tanaka［13］將編碼牛乳鐵蛋白（bLF）的基因插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，然后分離表達(dá)bLF的重組病毒，使用抗bLF的單克隆抗體從重組的桿狀病毒中檢測到約80ku的bLF相關(guān)蛋白，并證明rbLF在氮末端含有糖蛋白結(jié)合位點，與天然的bLF一樣，佐普夫桿菌（Protothecazopfii）對rbLF也較敏感。趙昆等［14］將牛抗菌肽 Bac7－Bac5－βdefense串聯(lián)基因克隆到BAC－TO－BACTM重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的pFAST HTb載體中，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)座載體pFASTBac－Bac7－Bac5－βdefense，轉(zhuǎn) DH10Bac大腸桿菌（Escherichiacoli）感受態(tài)細(xì)胞，PCR方法篩選陽性菌落，抽提大分子質(zhì)粒DNA，獲得重組桿狀病毒穿梭載體 Bacmid－Bac7－Bac5－βdefense，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收集含有重組病毒顆粒的培養(yǎng)上清，通過SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定可見表達(dá)的融合蛋白分子量大小為20Kd，表達(dá)量約占細(xì)胞總蛋白的10.6%。體外抑菌試驗表明，重組的rBac7－Bac5－βdefense蛋白對大腸桿菌BL21具有抑菌活性。楊斯琦等［15］成功地將鐮形扇頭蜱體內(nèi)的抗菌肽M50的全長基因克隆到Bac－To－Bac桿狀病毒系統(tǒng)中，結(jié)果表達(dá)出來的重組蛋白能被抗原核表達(dá)的M50蛋白血清識別，也能被標(biāo)簽His單抗識別。許丹等［16］將shivala基因克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pBacFast－Dual中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選得到重組桿狀病毒DNA，以脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞病變出現(xiàn)后，收集上清液從而獲得重組桿狀病毒。結(jié)果抑菌試驗表明，表達(dá)的shivala多肽對大腸桿菌（DE3菌株）具有抑菌活性。

與大腸桿菌表達(dá)載體相比，桿狀病毒表達(dá)載體具有操作相對簡便、而且昆蟲細(xì)胞較易培養(yǎng)且成本低、外源基因表達(dá)量高，具有與哺乳動物細(xì)胞相似的蛋白翻譯后修飾功能。但這種修飾有一定限度，雖然其糖基化位點與在哺乳動物細(xì)胞中一樣，但寡糖鏈的性質(zhì)有所不同，無法產(chǎn)生復(fù)雜的糖基側(cè)鏈，這可能是由于昆蟲細(xì)胞不能將成熟糖鏈加工成哺乳動物細(xì)胞中那樣的形式。因此，在使用桿狀病毒載體表達(dá)某些抗原時無法保持其天然狀態(tài)。另外用該系統(tǒng)表達(dá)的抗菌肽種類比較少，可能與桿狀病毒宿主范圍較狹窄有關(guān)。

3 動物抗菌肽在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，其兼有原核生物和真核生物的特點，近年來應(yīng)用最廣泛的是巴斯德畢赤酵母，它是一種能高效表達(dá)重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，在DNA重組技術(shù)中得到越來越廣泛的應(yīng)用。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有的優(yōu)點是：畢赤酵母表達(dá)載體是以整合型載體為主，外源基因通過質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組中，這樣得到的基因工程菌株比較穩(wěn)定，糖基化程度低。常見的整合型載體又分為胞內(nèi)表達(dá)載體和分泌表達(dá)載體。胞內(nèi)表達(dá)通常適合于在胞漿中表達(dá)不含二硫鍵的非糖基化蛋白，雖比胞外分泌水平高，但產(chǎn)物純化相對復(fù)雜；胞外分泌表達(dá)的外源蛋白純化非常方便，所以分泌表達(dá)載體倍受青睞。

Hong等［17］運用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了人皮膚抗菌肽 LL－37，該基因裝載于 pGAPZ－E/LL－37載體，轉(zhuǎn)染畢赤酵母X－33，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果目的蛋白以分泌的形式表達(dá)，產(chǎn)物純化后對藤黃微球菌（Micrococcusluteus）具有抗菌活性。該研究表明，抗菌肽可以通過酵母真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，而不必與其他蛋白融合。江學(xué)斌等［18］成功實現(xiàn)了抗菌肽Cecropin AD基因在畢赤酵母X－33中的組型表達(dá)pGAPZαA，表達(dá)后的蛋白對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等均具有明顯的抑殺作用，抗菌肽的組成型表達(dá)方法得到了成功應(yīng)用，為以后的規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。徐婉芳等［19］將擬穴青蟹抗菌肽scygonadin基因成熟肽片段構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pPIC9K中，通過電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GSl15，經(jīng)篩選和鑒定證實了目的基因已穩(wěn)定整合入酵母基因組中。以甲醇誘導(dǎo)表達(dá)陽性克隆，上清中表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過Tricine－SDS－PAGE鑒定與預(yù)期的目的蛋白大小（約10ku）相符，并利用瓊脂擴(kuò)散試驗證明，表達(dá)產(chǎn)物能抑制革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的生長，對酵母和真菌沒有抑制作用，說明畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)更容易使表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性。李青等［20］根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性，將一種新型食品生物防腐劑－多聚陽離子抗菌肽（PCAP）連接克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9并轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115，用0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，通過Tricine－SDS－PAGE分析該融合蛋白已成功地在畢赤酵母中表達(dá)。在pH值2條件下將表達(dá)產(chǎn)物采用胃蛋白酶酶解，分離得到的堿性多聚陽離子肽對食品腐敗微生物枯草芽孢桿菌具有明顯的抑菌作用。劉德輝等［21］成功的將蠶新型抗菌肽Cryptonin克隆到pPICZAα－C質(zhì)粒中，獲得的重組酵母表達(dá)載體通過SacⅠ酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至X－33中，PCR檢測Cryptonin基因與畢赤酵母染色體穩(wěn)定結(jié)合，Zeocin抗性篩選得到高拷貝轉(zhuǎn)化子，在AOX1啟動子的調(diào)控作用下獲得分泌表達(dá)產(chǎn)物Cryptonin蛋白，且表達(dá)產(chǎn)物耐熱性強(qiáng)，在100℃條件下10min內(nèi)抗菌活性不變，煮沸30min以上仍具有活性，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖擴(kuò)散檢測對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都具有很好的抑菌活性，為抗菌肽的分子設(shè)計和進(jìn)一步大量生產(chǎn)研發(fā)新型抗菌藥物奠定了一定的基礎(chǔ)。Wang等［22］將雜合抗菌肽CECA－MAG及其突變體的合成在畢赤酵母中成功地分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物能夠抑制大多數(shù)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的生長。Tang等［23］運用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了牛 Lactoferrampin－Lactoferricin（LFALFC）抗菌肽，將該基因裝載于pPICZαA－LFA－LFC載體，電轉(zhuǎn)化于KM71，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果目的蛋白以分泌形式表達(dá)經(jīng)純化后對大腸桿菌有較強(qiáng)的抑菌活性。

目前在抗菌肽基因工程表達(dá)中應(yīng)用最多的是分泌型表達(dá)載體pPICZα的3個類型、pGAPZα的3個類型和pPIC9K進(jìn)行酵母表達(dá)，相比而言這些載體的相同點是都具有分泌效率高的α－factor，不僅能對宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷有所減輕，還可以減少宿主細(xì)胞蛋白水解酶對外源蛋白的降解。在表達(dá)載體端啟動子序列的下游，均提供外源基因插入的多克隆位點，并且多克隆位點的下游還包含便于檢測外源蛋白的myc表位和便于純化蛋白的多組氨酸標(biāo)記，以及有利于mRNA的穩(wěn)定AOX1 3′端終止序列。不同的是，pPIC9K屬于酵母菌和大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒，帶有氨芐基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞要用Amp抗性篩選，轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞要先用His缺陷篩選陽性克隆，再利用G418篩選多拷貝；而pPICZα的3個類型和pGAPZα的3個類型的載體均具有Zeocin抗性篩選標(biāo)記基因，重組轉(zhuǎn)化子可直接用Zeocin進(jìn)行篩選，即在YPDZ平板生長的轉(zhuǎn)化子中，100%都有外源基因的整合，大大簡化了重組轉(zhuǎn)化酵母的篩選過程。在操作過程中，Zeocin也可用來篩選含表達(dá)載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，相比pPIC9K不必另外使用氨芐青霉素，經(jīng)濟(jì)而又簡單。另外，pPIC9K和pPICZα的三個類型的載體具有較強(qiáng)的可調(diào)控啟動子AOX1，來嚴(yán)格控制外源基因的表達(dá)；而pGAPZα的三個類型的載體則具有不需要甲醇誘導(dǎo)的3－磷酸甘油醛脫氫酶（GAP）強(qiáng)啟動子，在宿主細(xì)胞中成組型表達(dá)。這樣就避免了使用有毒的甲醇為誘導(dǎo)原料的缺點，是一種理想的分泌型載體。

綜上所述，畢赤酵母及桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)既具有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的操作簡單，細(xì)胞易培養(yǎng)，成本低，表達(dá)量高等優(yōu)點；又具有比大腸桿菌更為完善的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力，并且不會產(chǎn)生內(nèi)毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌。由于桿狀病毒載體表達(dá)某些抗原時無法保持其天然狀態(tài)，且該系統(tǒng)表達(dá)的抗菌肽種類也比較少，限制了應(yīng)用；而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有醇氧化酶可調(diào)控的強(qiáng)啟動子，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達(dá)量高。同時，對高效分泌表達(dá)的外源蛋白，進(jìn)行翻譯后加工處理，將外源蛋白分泌到細(xì)胞外，不但提高表達(dá)蛋白的活性，且有利于產(chǎn)物的純化。因此，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在抗菌肽應(yīng)用上更為廣泛。本課題組也選擇了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，并成功構(gòu)建了類牛源LNK－16 6串聯(lián)抗菌肽畢赤酵母表達(dá)體系，為類牛源LNK－16 6串聯(lián)抗菌肽的大量表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

4 展望

隨著藥物殘留，耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，人們意識到有必要開發(fā)一類新型的抗生素。而抗菌肽具有廣譜的生物活性，殺菌迅速，不受傳統(tǒng)的抗生素耐藥菌株影響，與典型的抗生素具有協(xié)同作用有著抗生素?zé)o法比擬的優(yōu)點成為了人們關(guān)注的焦點。雖然利用基因工程的方法來獲得抗菌肽的嘗試已在原核體系和真核體系獲得成功，但是其真正成為一類藥物還需要解決一些問題。首先是如何能夠提高抗菌肽的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，提高表達(dá)效率，簡化提純方法，更有效地降低抗菌肽表達(dá)產(chǎn)物對宿主菌的毒性，還需要我們不斷地探索和研究。其次，與傳統(tǒng)抗生素比，一些抗菌肽的抗菌活性還不夠理想，通過已有的抗菌肽和設(shè)計新抗菌肽分子是提高活性的有效途徑。這就需要進(jìn)一步研究抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，為抗菌肽分子的改造和設(shè)計提供足夠的理論依據(jù)。相信隨著抗菌肽及基因工程技術(shù)在理論和應(yīng)用上的不斷深入研究，抗菌肽會對人類醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

［1］ Jenssen H，Hamill P，Hancock R E.Peptide Antimicrobial A－gents［J］.Clin Microbiol Rev.2006，19（3）：491－511.

［2］ 包散丹，李海燕.抗菌肽的研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì)，2008，160（3）：347.

［3］ Brahmachary M，Krishnan S P，Kohn，etal.Antimic：a database of antimicrobial sequences［J］.Nucleic Acids Res，2004，32（Databae issue）：D586.

［4］ Moon J Y，Henzler－Wildman K A，Ramamoorthy A.Expression and purification of a recombinant LL－37fromEscherichia coli［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1758（9）：1351.

［5］ 趙曉宇，馮興軍，孟利強(qiáng)，等.抗菌肽Lactoferricin B的原核表達(dá)及其純化［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，41（9）：67－71.

［6］ 王慶豐，韓躍武.鯰魚抗菌肽Parasin I原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定［J］.國外醫(yī)藥－抗生素分冊，2011，32（6）：279.

［7］ Chen L.Prokaryotic expression of antibiotic peptide Cecropin A gene and identification of expression products［J］.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2011，（15）：4549－4552.

［8］ 付登峰.類牛源抗菌肽LNK－16在大腸桿菌中的串聯(lián)表達(dá)［D］.鄭州：河南科技學(xué)院，2011：1－10

［9］ 劉誠，黎滿香，蔣偉，等.抗菌肽Dermadistinctin－K的原核表達(dá)及生物活性鑒定［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（05）：517－522.

［10］胡功鈴，陳國平，胡宗利，等.雜合抗菌肽HMCM的原核表達(dá)及其活性鑒定［J］.藥物生物技術(shù)，2012，19（1）：6－10.

［11］Jing X L，Luo X G，Tian W J，etal，High－Level Expression of the Antimicrobial Peptide Plectasin inEscherichiacoli［J］.Curr Microbiol，2010，61（3）：19.

［12］Luo X G，Lv L H，Jing X L，etal，Indipendent and Tandem Expression of a Novel Antimicrobial Peptides Plectasin in Escherichia coil［J］.Advanced Materials Research，2012，345：134－138.

［13］Tanaka T，Nakamura I，Kumura H.Expression of bovine lactoferrin and lactoferrin N－lobe by recombinant baculovirus and its antimicrobial activity against Prototheca zopfii［J］.Biochem Cell Biol，2003，81（5）：349－354.

［14］趙昆，劉思國，王春來，等.牛抗菌肽Bac7－Bac5－βdefense串聯(lián)基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)及其產(chǎn)物的活性分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2008，16（3）：380－384.

［15］楊斯琦，周勇志，張厚雙，等.抗菌肽M50基因在Bac－To－Bac桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2010，18（5）：49－53.

［16］許丹，許信剛，王志昇，等.Shivala基因在桿狀病毒中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性檢測［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，20（6）：33－37.

［17］Hong I P，Lee S J，Kim Y S，etal.Recombinant expression of human cathelicidin（hCAP18/LL－37）inpichiapastoris［J］.Biotechnol Lett，2007，29（1）：73－78.

［18］江學(xué)斌，張敏靜，林健聰，等.抗菌肽Cecropin AD在畢赤酵母中的組成型表達(dá)及中試發(fā)酵研究［J］.飼料工業(yè)，2011，32（19）：25－29.

［19］徐婉芳，謝嘉華，陳慧蕓.擬穴青蟹抗菌肽scygonadin在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性［J］.泉州師范學(xué)院學(xué)報，2011，29（6）：11－13.

［20］李青，周曉宏.新型生物防腐劑－多聚陽離子抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)［J］.食品科學(xué)，2012，3：1－8.

［21］劉德輝，焦穎，徐蕙，等.蟬新型抗菌肽Cryptonin在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性鑒定［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30（6）：806－810.

［22］Wang X Q，Zhu M X，Zhang A J，etal.Synthesis and secretory expression of hybrid antimicrobial peptide CecA－mag and its mutants inPichiapastoris［J］.Society for Experimental Biology and Medicine，2012，237（3）：312.

［23］Tang X S，Tang Z R，Wang S P，etal.Expression，Purification，and Antibacterial Activity of Bovine Lactoferrampin－Lactoferricin inPichiapastoris［J］.Appl Biochem Biotechnol，2012，166：640－651.