雞傳染性支氣管炎病毒黏膜免疫研究進(jìn)展

何怡寧，鄭衍生，磨美蘭

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530005）

雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的雞傳染性支氣管炎（IB）是一種具有高度傳染性的病毒性呼吸道疾病，主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，不同日齡均能感染，雛雞最易感。盡管廣泛使用疫苗，但I(xiàn)B仍頻繁發(fā)生［1］。因此，做好IB的預(yù)防控制具有極其重要的意義。IBV致病機(jī)制的研究是IB防控的主要方向之一，而IBV是典型的嗜黏膜病原，主要通過呼吸道黏膜途徑感染機(jī)體，因此黏膜免疫研究是IBV致病機(jī)制研究的重中之重。黏膜免疫研究可為黏膜疫苗和佐劑的研究提供新思路和方法，為防控IB奠定基礎(chǔ)。目前有關(guān)學(xué)者對IBV感染的黏膜免疫進(jìn)行了一些初步研究。本文將對IBV感染的黏膜免疫的最新研究進(jìn)展作一綜述，為IBV相關(guān)研究提供重要參考。

1 黏膜免疫系統(tǒng)的構(gòu)成

黏膜由上皮組織和結(jié)締組織構(gòu)成，覆蓋于呼吸道、消化道及泌尿生殖道等部位，與外界環(huán)境直接接觸，是病原微生物侵入機(jī)體的門戶。家禽黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)不可分割的重要組成部分，也是免疫系統(tǒng)的第一道防線。禽類黏膜免疫系統(tǒng)由黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）和彌散性免疫細(xì)胞兩部分組成，MALT包括鼻相關(guān)淋巴組織（NALT）；眼相關(guān)淋巴組織（CALT），如哈德爾氏腺；支氣管相關(guān)淋巴組織（BALT）；腸相關(guān)淋巴組織（GALT），如盲腸扁桃體、派伊爾結(jié)（PP），按解剖和功能分為誘導(dǎo)部位和效應(yīng)部位［2］。

誘導(dǎo)部位包括GALT的PP和微皺褶細(xì)胞（M細(xì)胞）、腸上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC），以及NALT，CALT和BALT。M細(xì)胞不能遞呈抗原，主要以受體介導(dǎo)胞吞的方式非特異性攝取和轉(zhuǎn)運抗原。在黏膜相關(guān)淋巴組織中接觸抗原后，黏膜淋巴細(xì)胞離開誘導(dǎo)部位，回到黏膜效應(yīng)組織發(fā)揮作用，而黏膜免疫應(yīng)答的效應(yīng)部位分布廣泛。效應(yīng)免疫細(xì)胞包括上皮淋巴細(xì)胞，固有層淋巴細(xì)胞，T細(xì)胞、B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞（DC），肥大細(xì)胞和腔內(nèi)淋巴細(xì)胞。此時，DC能捕獲抗原但不遞呈抗原，而直接調(diào)節(jié)B細(xì)胞反應(yīng)。

黏膜免疫的主要功能是在黏膜表面向宿主提供局部免疫防御作用，并誘導(dǎo)全身免疫反應(yīng)，包括固有免疫和獲得性免疫。經(jīng)黏膜部位免疫，如滴鼻點眼等，能同時誘導(dǎo)局部黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，而經(jīng)肌肉或皮下注射免疫能引起強烈的系統(tǒng)免疫應(yīng)答，但幾乎不能誘導(dǎo)有效的局部黏膜系統(tǒng)免疫應(yīng)答。Du［3］等研究發(fā)現(xiàn)，與肌肉注射接種相比，經(jīng)鼻接種引起的全身體液免疫反應(yīng)強度相當(dāng)?shù)掷m(xù)時間較短，局部體液免疫反應(yīng)更強烈些，同時引起較強的全身和局部的特異性CTL的反應(yīng)。

2 IBV黏膜固有免疫應(yīng)答

固有免疫應(yīng)答是體內(nèi)固有免疫細(xì)胞和分子識別、結(jié)合病原體及其產(chǎn)物或抗原性異物后，被迅速活化產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)，將病原體等抗原性異物殺傷、清除的過程。固有免疫在機(jī)體非特異性抗感染免疫過程、特異性免疫應(yīng)答的啟動、調(diào)節(jié)和效應(yīng)階段發(fā)揮著重要作用。

研究表明，黏膜免疫IBV H120或M41株5d后再感染大腸桿菌，與大腸桿菌單獨感染相比，巨噬細(xì)胞在感染雞的氣管、肺和氣囊部位募集時間更早，感染0.5h后立即出現(xiàn)，數(shù)量明顯更多，且持續(xù)時間更長，第7天才有所降低［4］，說明了IBV感染調(diào)節(jié)了黏膜固有免疫細(xì)胞的應(yīng)答。

感染IBV后，宿主黏膜部位許多固有免疫相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平發(fā)生變化，表明黏膜固有免疫系統(tǒng)被有效激活。Wang［5］等研究了感染弱毒IBV 3d后雞氣管上皮層的基因轉(zhuǎn)錄圖譜，發(fā)現(xiàn)25個與免疫應(yīng)答直接相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，包括Toll樣受體2（TLR2）、TLR3、干擾素誘導(dǎo)的抗病毒基因（Mx）、免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和趨化因子以及細(xì)胞因子受體γ鏈轉(zhuǎn)錄顯著增加，說明固有免疫應(yīng)答在感染早期激活以快速清除局部感染的病毒。Guo［6］等研究發(fā)現(xiàn)，首免弱毒IBV后，黏膜組織的一些固有免疫因子、TLRs、視黃酸誘導(dǎo)基因－1（RIG－1）、1型干擾素（IFN－I），白介素1β（IL－1β）和補體等被局部激活。TLR3和RIG－1是感染細(xì)胞的RNA感受器，作為雙鏈RNA依賴性蛋白激酶（PKR）能誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN－I和促炎性細(xì)胞因子。H120或M41分別單獨感染宿主，5d后再感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)共感染第1天，宿主肺組織IL－6、IL－8、IFNγ、IL－10和IL－1βmRNA的表達(dá)水平與大腸桿菌單獨感染的相似或略高，但共感染后第3天，這些細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平均高于大腸桿菌單獨感染組的水平，特別是M41的感染［7］，表明IBV感染從細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平，影響了感染雞體內(nèi)特定組織對大腸桿菌感染的應(yīng)答。IBV感染細(xì)胞中，促炎癥因子IL－6和IL－8表達(dá)的提高由p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）誘導(dǎo)，而后期p38MAPK途徑受到IBV誘導(dǎo)的雙特異性磷酸酶（DUSPs）的調(diào)控［8］。

IBV感染還可引起宿主蛋白如細(xì)胞因子、補體等參與了黏膜固有免疫對抗IBV感染的應(yīng)答。脾細(xì)胞來源的Ch IFN－I能抑制IBV Gray株在氣管環(huán)的復(fù)制［9］。有關(guān)學(xué)者運用雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，分析人工感染IBV H120疫苗株72小時后，雞胚氣管組織蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了一些與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫相關(guān)蛋白，推測蛋白TRIM27.2、泛素羧基酯酶L1表達(dá)上調(diào)，而Rho GDP解離抑制因子α、炎癥相關(guān)蛋白熱休克蛋白beta－1和膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)下調(diào)［10］。甘露聚糖凝集素（MBL）以急性期反應(yīng)的方式在抗IBV感染的固有免疫中起重要作用，它能激活補體，抑制病毒在氣管內(nèi)增殖［11］。

以上研究表明了IBV感染能迅速激活黏膜固有免疫應(yīng)答，同時黏膜固有免疫系統(tǒng)從細(xì)胞、分子及基因水平等多個方面對抗IBV感染。只有當(dāng)固有免疫被啟動后，適應(yīng)性免疫才會被激活，固有免疫通過多種細(xì)胞因子的調(diào)控，給適應(yīng)性免疫提供信息，并決定所需的適應(yīng)性免疫應(yīng)答類型。

3 IBV黏膜適應(yīng)性免疫應(yīng)答

先天免疫系統(tǒng)的屏障及細(xì)胞可溶成分，防止病原體的進(jìn)入很有效，但往往不能完全抵御病原體并預(yù)防疾病，在這一點上，需要特別關(guān)注適應(yīng)性免疫的防御機(jī)制，后者不僅消除特定的病原體，并具有免疫記憶，因此可起到預(yù)防的作用。根據(jù)參與免疫應(yīng)答細(xì)胞種類及其效應(yīng)機(jī)制的不同，可分為B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

3.1 體液免疫應(yīng)答 Kotani［12］等研究了感染IBV雛雞氣管的免疫組織化學(xué)及組織病變，發(fā)現(xiàn)感染后8小時，黏膜下層出現(xiàn)少數(shù)IgG＋，IgM＋和IgA＋細(xì)胞，隨后IgG＋和IgM＋細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，并在感染后第3天增加顯著，第4天達(dá)到高峰，第5天后逐漸下降，IgA＋細(xì)胞數(shù)量較IgG＋和IgM＋細(xì)胞少，B細(xì)胞主要存在于固有層，感染后14d，少量IgG＋和IgM＋細(xì)胞在固有層淋巴濾泡生發(fā)中心出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，哈德氏腺中SIgA陽性細(xì)胞主要圍繞各級導(dǎo)管上皮及腺上皮分布，部分漿細(xì)胞鑲嵌于腺上皮細(xì)胞之間，而氣管中則主要分布在氣管固有膜和黏膜上皮處，經(jīng)點眼或滴鼻免疫呼吸型IBV弱毒苗均能誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生較多的SIgA細(xì)胞［13］。IBV感染后哈德氏腺中IgM＋淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，共感染傳染性腔上囊病病毒第9天IgM＋淋巴細(xì)胞顯著下降［14］。

經(jīng)二次和三次免疫IBV核蛋白（NP），雞鼻腔洗液、氣管洗液和腸腔洗液SIgA－NP抗體水平顯著提高，而霍亂毒素亞基能顯著增強這些部位SIgANP抗體水平［15］。滴眼免疫H120及原核表達(dá)IBV rN和rS1，35d收集氣管沖洗物，H120免疫組IgA水平顯著高于其他組，而IgG水平在所有組中均較低［16］。首免IBV－Mass后，黏膜部位觸發(fā)B細(xì)胞活化和分化的許多重要信號分子基因表達(dá)顯著上調(diào)，隨后Igμ鏈（IgM）及Ig J鏈，Igγ鏈激活，二免后立即大幅上升，但沒有觀察到Igα鏈（IgA）的激活，實時RT－PCR結(jié)果顯示Igα鏈的轉(zhuǎn)錄受抑制，因此，IgA可能不是局部抗IBV的一個重要武器，二免后局部IgG 占主導(dǎo)［6］。

經(jīng)鼻眼接種IBV Gray株后3d至7d外周血和脾臟中出現(xiàn)抗體分泌細(xì)胞（ASC），7d至10d ASC數(shù)達(dá)到最高，比血清抗IBV IgG早出現(xiàn)3d至7d，ASC數(shù)量在10d至14d下降，而血清抗體呈上升趨勢，血清抗體并沒有與臨床癥狀或病毒滴度相關(guān)，外周血和脾臟記憶B細(xì)胞在3周至10周檢測到，脾記憶細(xì)胞只有受到抗原刺激后才分泌抗體［17］。

3.2 細(xì)胞免疫應(yīng)答 盡管體液或抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對抗胞外抗原特別有效，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)則專門消除細(xì)胞內(nèi)抗原，包括內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞的外源性抗原，或是胞內(nèi)生產(chǎn)的內(nèi)源性抗原。滴鼻接種H52，15d后用M41攻毒，發(fā)現(xiàn)免疫H52后細(xì)胞免疫反應(yīng)和抗體反應(yīng)同時增強，特異性CTL應(yīng)答先于血清IgG生成，特異性CTL反應(yīng)對控制IBV急性感染更重要，感染后期更依賴于抗體，尤其是血清抗體反應(yīng)［18］。

接種IBV后24h至60h，雛雞氣管的固有層血管周圍發(fā)現(xiàn)少數(shù)CD3＋，CD4＋和CD8＋細(xì)胞，3d至4d數(shù)量迅速增加，第5天達(dá)到峰值，CD3＋，CD4＋和CD8＋細(xì)胞分布廣泛，感染后第7天CD4＋細(xì)胞顯著減少，第14天CD3＋，CD8＋細(xì)胞數(shù)減少，固有層的淋巴濾泡中未發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞［12］。IBV與大腸桿菌混合感染后，氣管、肺和氣囊的CD4＋和CD8＋T細(xì)胞數(shù)量顯著多于大腸桿菌單獨感染組和PBS組［4］。IBV感染后哈德氏腺中CD4＋淋巴細(xì)胞數(shù)量先增多后減少，共感染雞傳染性貧血病毒CD4＋淋巴細(xì)胞顯著減少［14］。IBV感染后至少10周可檢測到外周血的記憶T細(xì)胞，感染3周至6周脾臟收集的IBV特異性CD8＋記憶T細(xì)胞可以保護(hù)同系雛雞免受IBV 急性感染［19］。

雞氣管黏膜部位抗原呈遞細(xì)胞及T細(xì)胞相關(guān)因子，在首免IBV后基因表達(dá)水平上調(diào)，局部Th1細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)及CTL標(biāo)記分子顆粒酶A，膜粘蛋白porimin和Fas/FasL的激活，表明早期誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)能有效的清除局部感染的病毒［6］。MBL作為一種具有與補體C1q相似結(jié)構(gòu)的固有模式識別分子，參與調(diào)節(jié)抗IBV的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，特異性抗體滴度在低血清MBL雞中最高，在高血清MBL雞中甘露糖似乎抑制特異性抗體的生產(chǎn)，另外，疫苗接種或感染后，高血清 MBL雞中CD4－CD8α＋T細(xì)胞減少CD4－CD8α－γδT細(xì)胞增加，表明在抗IBV保護(hù)中抗體和T細(xì)胞具有互補作用［20］。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，IBV入侵黏膜部位后，機(jī)體立即從免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、補體及抗體等多方面應(yīng)答以對抗IBV的感染。目前，有關(guān)IBV感染的黏膜免疫的研究取得了一定的進(jìn)展，但黏膜局部免疫應(yīng)答的實際作用及其機(jī)制，仍需要進(jìn)一步研究。有關(guān)學(xué)者對感染IBV的細(xì)胞、雞胚及雞氣管進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選出一些差異表達(dá)的分子，但是這些分子在黏膜免疫應(yīng)答中的具體功能，并以何種途徑參與到免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)中，是否為IBV感染特有，或是機(jī)體對抗病原體共有的，還存在諸多疑問，有待更深層次的研究。因此有必要加強IBV的黏膜免疫研究。

總之，黏膜免疫作為一種更具優(yōu)勢的免疫途徑，加上黏膜免疫系統(tǒng)獨特的功能，黏膜免疫在抗IBV感染中的重要性越來越受到重視。進(jìn)一步深入了解IBV感染對黏膜免疫影響的分子機(jī)制，將有助于闡明IBV感染的致病機(jī)制，為研究黏膜疫苗和佐劑用于IB的防控打下基礎(chǔ)。

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