飼料中牛羊源性成分的定性檢測——定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）法[1]

王小林 薛 靜

（河南省醫(yī)藥學(xué)校，河南 開封 475000）

瘋牛病（BSE）是發(fā)生在成年牛的一種慢性進(jìn)行性高致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，屬人獸共患病。自1985年在英國發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已波及30多個國家和地區(qū)。由瘋牛病引發(fā)的公共衛(wèi)生問題、社會經(jīng)濟(jì)和政治問題已超過瘋牛病本身。瘋牛病以其病原超強(qiáng)的抵抗力、傳播方式的特殊性、超長的潛伏期和高致死性正在成為有史以來對人類威脅最大的傳染病之一。瘋牛病主要通過食物鏈傳播，是由于牛食用了含有朊病毒的肉骨粉飼料所致，禁止含牛羊源性成分飼料的生產(chǎn),流通,使用,成為預(yù)防瘋牛病感染,流行的主要手段之一。對飼料中牛羊源性成分的檢測具有重要的意義[2]。本方法的最低檢出限為0.25%。

1 儀器，試劑與樣品

1.1 儀器

1.1.1 高壓滅菌鍋

1.1.2 離心機(jī)(micromax型,美國Thermo公司)

1.1.3 迷你旋渦混合器(minishaker)

1.1.4 水浴鍋

1.1.5 PCR儀(T-Gradient Thermoblock,德國Biometra公司)

1.1.6 電泳儀(PowerPace universal,Biorad公司)

1.1.7 凝膠電泳成像系統(tǒng)(GelDoc XR型,Biorad公司)

1.2 試劑[3]

除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑，水為滅菌雙蒸水。

1.2.1 動物源性植

1.2.2 物飼料基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)

1.2.3 電泳緩沖液:稱取 54 g Tris,27.5 g硼酸,20 mL EDTA溶液,然后用水定容到 1 L,使用時10倍

1.2.4 稀釋 Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane，

1.2.5 三(羥甲基)氨基甲烷,EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid，

1.2.6 乙二胺四乙酸。

1.2.7 10mg/mL溴化乙錠溶液

1.2.8 瓊脂糖 電泳純。

1.2.9 25 umol/L引物溶液

1.2.10 Taq DNA 聚合酶(5U/μL)Taq:Thermus aquaticu，

1.2.11 水生棲熱菌

1.2.12 各10mmol/L的四種脫氧核糖核甘酸混合液 (dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

1.2.13 DNA分子量標(biāo)

1.2.14 記物 100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp （大連寶生物）

1.3 樣品

從各地抽檢的16種飼料做牛羊源性成分檢測，同時作陽性對照，陰性對照，空白對照。

陰性對照:不含牛或羊成分的飼料中提取的DNA作為PCR反應(yīng)的DNA模板；

陽性對照:含牛或羊成分的飼料中提取的DNA作為PCR反應(yīng)體系的模板；

空白對照:用無菌重蒸餾水作為PCR反應(yīng)體系的模板。

2 方法

2.1 飼料中牛羊DNA的提取

取50mg研磨粉碎的動物源性飼料于離心管，依所用試劑盒中的操作提取DNA。如下:向管中加320μL緩沖液GA，振蕩；加20μL(20mgml-1)蛋白酶，混勻，65℃水浴 30min；加 340μL 緩沖液 GB，混勻，水浴10min；12000rmp離心2min，取上清液400μL于新管，向上清中加200μL無水乙醇混勻，將其全部加入一個吸附柱CB3中 （有收集管），離心2min倒掉廢液，放回收集管中；加500μL去蛋白液GD離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放回。再用漂洗液PW700μL，500μL分別洗吸附蛀，離心30秒，倒掉廢液，放回收集管；空離心2min后，室溫放數(shù)分鐘，將吸附柱轉(zhuǎn)入一新的離心管，加200μL洗脫液TE，放5min，離心 2min。 TE:Tris-Cl、EDTA 緩沖液。

2.2 PCR 反應(yīng)

向 200μLPCR 反應(yīng)管中依次加入 10×PCR 緩沖液 5μL，1μL 各10mmolL-1的四種脫氧核糖核甘酸混合液，引物溶液（含正向和反向引物）各 1μL，摸板 DNA10μL Taq DNA 聚合酶 1μL，加入滅菌水,使反應(yīng)體系達(dá)50μL。以4000r/min離心10s后，PCR擴(kuò)增，95℃恒溫1～3min；30次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)（95℃恒溫30～60s，56℃恒溫 30～60s，72℃恒溫 30～60s）；然后72℃恒溫5min，取出PCR反應(yīng)管。

2.3 PCR產(chǎn)物的電泳檢測

取 3g瓊脂糖加入200mL電泳緩沖液，加熱溶解，稍冷加12μL的EB混勻，倒膠，冷凝。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將5μL～8μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣。9V／cm恒壓，電泳30min，結(jié)束后將凝膠置于凝膠成像儀上成像，拍照。

3 結(jié)果

對所抽取的16個樣品做牛羊源性成分的檢測結(jié)果如下。每個樣品均做平行樣，前四個分別為M，陽性對照，陰性對照，空白對照。

在飼料中牛源性成分的檢測中，飼料編號為S2007C0254，S2007C0372，S2007C0374的三個中檢出結(jié)果為陽性。

在飼料中羊源性成分的檢測中，飼料編號為S2007C0254，S2007C0372的兩個中檢出結(jié)果為陽性。

4 討論

4.1 所取飼料要粉碎，顆粒大小在0.125mm以下；在DNA提取中，振蕩至徹底懸浮，且溫浴期間離心管底出現(xiàn)沉淀時也要將其振蕩至徹底懸浮；在樣品的水浴過程中，其間要混勻樣品2-3次；上清液與無水乙醇的體積比為1:2；空離心后放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)實驗；洗脫液TE的體積不少于50μL，體積過小影響回收效率。

4.2 PCR反應(yīng)儀有邊緣效應(yīng)，應(yīng)把PCR反應(yīng)管放中間位置，且PCR反應(yīng)管要蓋緊，否則會污染PCR儀。

4.3 在電泳的配膠加入溴化乙錠溶液時，要帶一次性手套。EB有致癌作用。

在整個操作過程中要注意防止交叉污染，嚴(yán)格操作。

［1］飼料中牛羊源性成分的定性檢測.GB/T 20190-2006定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法[S].

［2］瘋牛病的醫(yī)藥途徑性潛伏危害及建立相關(guān)檢測方法的迫切性[J].中國藥事，2002，16（4）.

［3］SN/T 1119-2002進(jìn)出口動物源性飼料中牛羊源性成分檢測方法 PCR方法[S].中國標(biāo)準(zhǔn)出版社.