3－苯基－2－（4－叔丁基苯氧基）－3′－氧環己烷并噻吩并［2，3－d］嘧啶－4（3 H）－酮的合成及其與BSA的相互作用

周 亮，陳 靜

（1．湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧437100；2．湖北科技學院核技術與化學生物學院，湖北 咸寧437100）

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白。藥物進入體內后都是通過與血清白蛋白的結合、運輸到達受體部位而發揮藥效的。因此，研究藥物小分子與蛋白質的相互作用對于了解藥物在體內如何儲存、運輸進而發生藥理作用具有重要的意義［1－6］。

噻吩并嘧啶酮類化合物是一類具有良好生物活性和藥理活性的雜環化合物，有些具有良好的抗濾過性病原體、抗驚厥、殺菌及除草等生物活性，還有些可以用作鎮定劑［7，8］。作者合成了3－苯基－2－（4－叔丁基苯氧基）－3′－氧環己烷并噻吩并［2，3－d］嘧啶－4（3 H）－酮（PTP），并采用紫外吸收光譜法和熒光光譜法，在生理條件下研究了不同溫度下PTP與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，考察了PTP對BSA構象的影響，為進一步研究PTP的藥物作用機理及藥物開發提供了重要信息。PTP的分子結構見圖1。

圖1 PTP的分子結構Fig．1 The molecular structure of PTP

1 實驗

1．1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA，中國科學院化學研究所）溶解在Tris－HCl（0．05mol·L－1Tris＋0．10mol·L－1NaCl，pH＝7．4）緩沖溶液中，BSA溶液在實驗前15 min配制；其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

BS124S型電子分析天平，北京賽多利斯；PHS－3C型pH計，江蘇江分；UV－2300型紫外可見分光光度計、F－4500型熒光分光光度計（帶恒溫系統），日本日立。

1．2 PTP的合成

向干燥的50mL圓底燒瓶中加入1．461g（3mmol）膦亞胺，再加入約10mL四氫呋喃使其溶解，并快速加入等摩爾的芳基異氰酸酯，密閉于冰箱干燥器中靜置8h或12h，所得碳二亞胺無需純化，直接在攪拌下加入到溶有3mmol酚和一定量的固體碳酸鉀的四氫呋喃溶液中，40～45℃下攪拌過夜，過濾，減壓蒸去溶劑，殘余物以乙醇和二氯甲烷重結晶，得到2－芳氧基吡喃并噻吩并嘧啶酮衍生物PTP。

1．3 熒光光譜測試

以DMF為溶劑配制濃度為5．0×103mol·L－1的PTP儲備液以及不同溫度（T＝298K、302K、306 K、310K）下pH＝7．4的Tris－HCl緩沖溶液。

在1cm的比色皿中加入2mL濃度為1×10－5mol·L－1的BSA溶液，以λ＝295nm激發，激發狹縫和發射狹縫均為5nm，測定熒光光譜。然后逐次加入2μL PTP，測定系列溶液在不同溫度下300～500nm的熒光光譜。

2 結果與討論

2．1 PTP的波譜數據

IR（KBr），ν，cm－1：1698（C＝O），1602（C＝N），1572、1556、1497、1444（C＝C），1260（C－N），1219（C－O－C）。

1HNMR（300MHz，CDCl3），δ：1．29（s，9H，3CH3）；3．08（2H，CH2）；4．00（s，2H，CH2）；4．76（s，2H，CH2）；7．05（m，9H，C6H5，C6H4）。

MS，m／z，%：432（60）［M＋］，346（17），283（29），257（38），253（59），227（100），181（58），119（41），77（31）。

2．2 熒光光譜分析

BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，因而具有內源性熒光。當激發波長為295nm時，BSA熒光發射峰位置在346nm附近；以同樣激發波長激發5．0×103mol·L－1PTP溶液，在346nm附近沒有熒光。這證明PTP不會產生與BSA相互干擾的熒光。298K下，保持BSA濃度不變、加入不同濃度的PTP，BSA的熒光光譜見圖2。

圖2 不同濃度PTP存在下BSA的熒光光譜Fig．2 The fluorescence spectra of BSA in the presence of different concentrations of PTP

從圖2可以看出，隨著PTP濃度的增大，BSA的內源性熒光強度有規律地降低，說明PTP能夠猝滅BSA的熒光，兩者之間存在著相互作用。

2．3 猝滅機理的推斷

引起BSA熒光猝滅的機理通常為動態猝滅和靜態猝滅兩種類型。動態猝滅是猝滅劑分子與熒光物質的激發態之間發生能量轉移或電子轉移，生成瞬時的激發態復合物，從而引起熒光猝滅。動態猝滅常數會隨著溫度的升高而增大。其過程遵循Stern－Volmer方程［9］：

式中：F、F0分別為有、無猝滅劑時的熒光強度；Kq為雙分子猝滅過程的速率常數；KSV為Stern－Volmer猝滅常數；τ0為猝滅劑不存在時生物大分子的平均壽命，約為10－8s；［Q］為猝滅劑濃度。通常各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數為2．0×1010L·mol－1·s－1。

根據Stern－Volmer方程，繪制不同溫度下（T＝298K、302K、306K 和310K）的［（F0／F）－1］～［Q］曲線，見圖3。

圖3 不同溫度下PTP對BSA熒光猝滅的Stern－Volmer曲線Fig．3 Stern－Volmer plots for fluorescence quench of BSA by PTP at different temperatures

依據圖3中猝滅曲線的斜率求得298K、302K、306K和310K時的熒光猝滅常數KSV分別為1．115×105L·mol－1、1．012×105L·mol－1、0．986×105L·mol－1、0．837×105L·mol－1。可以明顯看出猝滅常數是隨著溫度的升高而減小的，表明PTP對BSA的熒光猝滅應為靜態猝滅機理。進一步求得298K、302K、306K、310K下的猝滅速率常數Kq分別為1．115×1013L·mol－1·s－1、1．012×1013L·mol－1·s－1、0．986×1013L·mol－1·s－1、0．837×1013L·mol－1·s－1。均遠遠大于2．0×1010L·mol－1·s－1，再次說明引起BSA溶液體系熒光猝滅的主要原因是靜態猝滅。

2．4 作用力類型的確定

PTP與BSA的靜態猝滅作用可以用Lineweaver－Burk雙倒數函數方程進行描述：

式中：KLB為靜態熒光猝滅的結合常數，用來描述靜態猝滅過程中猝滅劑與生物大分子的結合反應達到平衡時的量效關系。

繪制（F0－F）－1～［Q］－1曲線，依據其斜率和截距求出KLB的值，并進一步求出熱力學參數ΔHθ、ΔGθ、ΔSθ，見表1。

表1 不同溫度下PTP與BSA相互作用的Lineweaver－Burk線性回歸方程、結合常數KLB、熱力學參數Tab．1 Binding constant KLB，Lineweaver－Burk linear regression equation and thermodynamic parametersfor interaction between PTP and BSA at different temperatures

在靜態猝滅過程中，靜態猝滅熒光強度與猝滅劑之間的關系可由熒光－猝滅劑分子間的表觀結合常數表達式導出［8］：

式中：Ka為猝滅劑與BSA之間的表觀結合常數；n為結合位點數。

從表1可以看出，KLB的數值較大，表明PTP和BSA之間存在著較強的相互作用，且KLB隨著溫度的升高而減小。

根據反應前后熱力學焓變ΔHθ和熵變ΔSθ的相對大小，可以判斷藥物分子與蛋白質之間的主要作用力類型：ΔHθ＜0、ΔSθ＜0時，為范德華力和氫鍵；ΔHθ≈0、ΔSθ＞0時，為靜電引力；ΔHθ＞0、ΔSθ＞0時，為疏水作用力。從表1可以看出，PTP與BSA的相互作用是自發的（ΔGθ＜0），且ΔHθ＜0、ΔSθ＜0，可以認為PTP與BSA之間的作用力主要是范德華力和氫鍵［10］。

2．5 表觀結合常數及結合位點數的計算

表2 不同溫度下的表觀結合常數Ka和結合位點數Tab．2 Binding constant Kaand the number of binding site at different temperatures

從表2可以看出，在不同溫度下（pH＝7．4），PTP與BSA的結合位點數n均接近1，說明PTP與BSA形成1個結合位點；Ka隨著溫度的升高逐漸增大，說明PTP與BSA形成了比較穩定的終合物［11］。

2．6 結合距離的計算

根據Fster的無輻射能量轉移理論，能量轉移效率E與供體－受體間距離r、臨界能量轉移距離R0之間有如下關系式［12］：

式中：R0為轉移效率為50%時的臨界距離。R0可由下式求出：

式中：K2為偶極空間取向因子；n為介質的折射指數；Φ為供體的熒光量子產率；J為供體的熒光發射光譜與受體吸收光譜的光譜重疊積分，即：

式中：F（λ）為熒光受體在波長λ處的熒光強度；ε（λ）為受體在波長λ處的摩爾吸光系數。

PTP與BSA的摩爾比為1∶1時，PTP的紫外吸收光譜與BSA熒光光譜的重疊見圖4。

圖4 PTP吸收光譜（a）與BSA熒光光譜（b）的重疊Fig．4 Overlap of PTP absorption spectrum（a）and BSA fluorescence spectrum（b）

依據圖4中的光譜重疊部分按式（6）求出J。在上述條件下，取向因子取供體－受體各項隨機分布的平均值，即K2＝2／3；折射指數取水和有機物的平均值，即n＝1．36；BSA中色氨酸殘基的熒光量子產率Ф＝0．15；通過計算機輔助計算，求得PTP與BSA內氨基酸殘基分子間的距離r＝1．78nm，符合能量轉移理論。這就表明PTP與BSA是足夠靠近的（r＜8nm），兩者之間是通過非輻射能量轉移的結合。

2．7 PTP對BSA構象的影響

采用同步熒光光譜法，固定BSA的濃度、逐漸增大PTP的濃度，記錄Δλex＝15nm和Δλex＝60nm 時的同步熒光光譜。結果發現，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的最大發射波長基本不變，說明PTP的加入并未使BSA的構象發生明顯的改變。

3 結論

通過Aza－Wittig反應，碳二亞胺與酚類化合物在堿性催化條件下成環，合成3－苯基－2－（4－叔丁基苯氧基）－3′－氧環 己 烷 并 噻 吩 并 ［2，3－d］嘧 啶 －4（3 H）－酮（PTP）。采用紫外吸收光譜法、熒光光譜法研究了PTP與BSA之間的相互作用，并考察了PTP的加入對BSA構象的影響。結果表明，PTP對BSA的熒光猝滅機理為靜態猝滅過程，PTP與BSA的結合反應為自發進行，反應中主要作用力是氫鍵和范德華力，兩者的結合位點數為1、結合距離為1．78nm，PTP的加入對BSA構象沒有明顯影響。對進一步探索PTP在醫學上的應用有著重要參考價值。

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